来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
核黄素（维生素B2）生物合成途径中，十二面体状的6,7-二甲基-8-核糖基黄素合酶（LS）笼状结构如何精确包裹三聚体核黄素合酶（RS），其分子机制长期悬而未决。本研究利用冷冻电镜技术解析了Aquifex aeolicus来源的RS/LS复合物结构，揭示了一套分层组装机制：RS通过C末端定位信号肽锚定在LS五聚体间界面的"pre-C3"区域，多价相互作用稳定开放中间态，延缓笼体闭合以延长装载窗口，最终通过构象门控和分子锁确保3:1的精确化学计量。该机制为合成生物学中可编程化学计量的人工催化区室设计提供了天然范本。
研究背景
酶在蛋白质区室内的隔离是细胞优化代谢和生物合成反应的普遍策略。通过物理屏障控制分子通量，这些壳结构建立高局部浓度的催化剂和中间体，增强途径效率并减少副反应。蓝藻类细胞器样区室——羧酶体是典型代表，其蛋白质壳包裹核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）和碳酸酐酶（CA），通过选择性碳酸氢盐摄取和腔内CA催化的CO2转化，克服RuBisCO的低周转率和底物特异性差的缺陷。此类系统中，壳形成蛋白和客体酶的适当比例对预期形态和反应通量至关重要。
核黄素合酶（RS）/6,7-二甲基-8-核糖基黄素合酶（LS）复合物是某些细菌中发现的核黄素（维生素B2）生物合成蛋白质区室。由LS形成的十二面体笼（催化核黄素生物合成倒数第二步）包裹同源三聚体RS（途径中的后续酶）。尽管这一策略具有代表性，但决定这种化学计量酶封装（3:1的客体与笼比例）的分子基础一直悬而未决。
研究方法
材料：所有盐和缓冲液组分购自Merck-Millipore（美国马萨诸塞州伯灵顿）、New England BioLabs（美国马萨诸塞州伊普斯维奇）或Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），除非另有说明。寡核苷酸由Merck-Millipore合成。大肠杆菌菌株BL21-Gold(DE3)和DH5α感受态细胞分别购自Agilent（美国加利福尼亚州圣克拉拉）和Thermo Fisher Scientific。质粒pMG_AaLS-wt、pACYC_Ptet_AaRS和pACYC_Ptet_sfGFP-AaRS196-207由Donald Hilvert教授（瑞士苏黎世联邦理工学院）惠赠。本研究中使用的所有蛋白质、质粒和寡核苷酸分别列于补充表4-6。
分子克隆：使用pET15_AaLS-wt-Strep67作为模板，以寡核苷酸FW_AaLS_XX和RV_AaLS_XX（XX对应引入的突变，补充表6）作为引物，通过快速突变聚合酶链式反应制备含单个丙氨酸的AaLS突变体质粒。编码BaLS、CtLS、HpLS、SaLS、TmLS或SoLS的密码子优化LS基因（带C末端Strep标签）以及编码BaRS、CtRS、HpRS、SaRS、TmRS或SoRS的RS基因由GenScript Biotech B.V.（荷兰赖斯韦克）合成，并通过NdeI/XhoI位点亚克隆至pET15或pACYC_Ptet载体。所有克隆步骤均使用大肠杆菌DH5α作为宿主细胞。质粒序列由Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH（德国慕尼黑）通过DNA Sanger测序确认。
AaRS/AaLS复合物的生产与纯化：将转化了pMG_AaLS-wt和pACYC_Ptet_AaRS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)-gold菌株在LB培养基（50 mL）中培养至OD600达到0.6–0.8，此时用0.2 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和5 µg/mL四环素诱导蛋白质生产。在25 °C培养18–20小时后，通过5000 × g、4 °C离心10分钟收获细胞，并储存于−20 °C直至纯化。细胞沉淀重悬于25 mL含200 mM NaCl的0.1 M磷酸钠（Na-Pi）缓冲液（pH 8.0）中，补充0.5 mg/mL溶菌酶和5 µg/mL DNase I。超声破碎细菌后，通过9500 × g、25 °C离心25分钟去除不溶性组分。AaLS蛋白（C末端带His6标签）使用HisPur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）通过亲和色谱从所得上清液中纯化。用含200 mM NaCl和20 mM咪唑的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）洗涤，用含200 mM NaCl和500 mM咪唑的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）洗脱蛋白。随后使用Amicon Ultra离心装置（50 kDa MWCO）将缓冲液置换为含200 mM NaCl和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）。所得溶液通过Superose 6 increase 10/300柱（Cytiva）进行尺寸排阻色谱，使用含200 mM NaCl和5 mM EDTA的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）在室温（RT）下以0.75 mL/min流速运行。收集峰组分，浓缩，并在室温下保存直至进一步实验。蛋白质浓度通过280 nm吸光度测定，使用为AaLS计算的消光系数（ε280 = 13,980 M⁻¹cm⁻¹）。蛋白质纯度及与AaRS的复合物形成通过考马斯亮蓝R350染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认。
单独生产AaLS时，使用仅含pMG_AaLS-wt的细胞，用0.2 mM IPTG诱导，其余步骤相同。单独生产AaRS时，仅含pACYC_Ptet_AaRS的细胞用5 µg/mL四环素诱导，按上述方法进行细胞裂解。澄清裂解液经0.22 μm过滤后进行硫酸铵沉淀。沉淀蛋白通过离心收集，溶于10 mM Tris-HCl（pH 8.9），在PD-10柱（Cytiva）上脱盐，并使用HiTrap Q HP柱（Cytiva）通过阴离子交换色谱纯化，用10 mM Tris-HCl（pH 8.9）中0–50%线性梯度的1 M NaCl洗脱。收集峰组分，缓冲液置换为10 mM Tris-HCl（pH 8.9），并在Mono Q 5/50 GL柱（Cytiva）上进一步精纯。纯化蛋白随后在Superdex 200 Increase 10/300柱（Cytiva）上进行尺寸排阻色谱，柱平衡液为含200 mM NaCl和5 mM EDTA的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）。收集峰组分，浓缩，用于质谱光度测定。
AaRS的质谱光度测定：测量在Refeyn Ltd. OneMP质谱光度计上进行。硼硅酸盐盖玻片（#1.5，24 × 50 mm²；Thorlabs）依次在超纯水、异丙醇和超纯水中超声清洗，并在氮气流下干燥。将干净的硅胶垫圈安装到盖玻片上，加入9 μL测量缓冲液进行对焦。纯化的AaRS在同一缓冲液中稀释至约10–30 μg/mL，采集前立即加入1 μL稀释样品。以100帧/秒的速度记录影片，使用5×帧合并和4×像素合并，每次测量共采集100,000帧。原始数据在DiscoverMP v2.0.3中使用默认参数处理，启用平均化和反射率校正，分子质量分布从校准对比度值获得。
冷冻电镜（cryo-EM）载网制备：纯化的LS笼使用Amicon Ultra离心装置（30 kDa MWCO）浓缩至1 mg/mL，将3.5 μL样品施加到新鲜辉光放电的Quantifoil R2/1 Cu 200目载网（Quantifoil Micro Tools GmbH，德国Großlöbichau）上。对于AaRS/AaLS包合物，使用0.5 mg/mL蛋白质和氧化石墨烯涂覆的载网。使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在100%相对湿度和4 °C下将载网在液态乙烷中玻璃化。玻璃化参数包括等待时间30秒，总吸干次数2，吸干力3，吸干时间3秒。
单颗粒重构的冷冻电镜数据采集：冷冻电镜影片数据集在波兰国家同步辐射中心（SOLARIS）的Titan Krios G3显微镜（Thermo Fisher Scientific）上采集，工作电压300 kV，标称放大倍数×105,000，校准像素尺寸0.8456 Å/像素。配备BioQuantum成像滤波器（20-eV狭缝）的K3直接电子探测器（Gatan，美国加利福尼亚州普莱森顿）以计数模式运行。成像区域暴露总剂量为40 e⁻/Ų，对应剂量率约16 e⁻/像素/秒。在0.9至2.1 μm的离焦值范围内以0.3 μm增量记录四十帧影片堆栈。每个数据集采集的影片数量为5000至10,000（补充图1和3）。采集的数据集使用cryoSPARC v4.5.3处理。
AaRS/AaLS包合物的冷冻电镜单颗粒重构：一个包含8625部影片的数据集使用patch motion correction和patch CTF estimation处理。随后的3D模板颗粒拾取获得2,539,751个2×合并颗粒，经2D分类后选择1,749,455个（数据集的100%）（补充图1a）。在无对称性（C1）条件下进行从头重构，随后使用四面体（T）对称性进行均匀3D精修，并对称性松弛至C1。所得12五聚体笼用于生成包裹组装体壳层的软3D掩膜。相应颗粒随后在4 Å分辨率下进行四轮3D分类，分为十类，应用软掩膜。基于结构特征对颗粒进行人工检查和重新分配，最终分为五组：具有二十面体（I）对称性的12五聚体笼、……
研究结果
AaRS锚定在AaLS五聚体-五聚体界面
我们首先表征了AaLS和AaRS各自的四级结构，作为研究它们相互作用的起点。两种蛋白质均在大肠杆菌中异源生产并纯化用于结构表征。已知AaLS形成由60个原体组成的十二面体结构，本研究通过冷冻电镜单颗粒重构也证实了这一点（图1b）。AaRS包含串联催化位点、卷曲螺旋结构域和CLS（图1c），预测形成同源三聚体，类似于大肠杆菌直系同源物的晶体结构，其中卷曲螺旋结构域介导三聚化。纯化AaRS的质谱光度测定验证了这一预测，显示表观分子质量为67 kDa，与同源三聚体的理论质量（69 kDa）密切吻合（图1d）。这些结果证实重组AaLS和AaRS分别固有地组装为十二面体和同源三聚体。
为表征AaRS/AaLS复合物，将AaRS和Strep标签标记的AaLS在大肠杆菌中共表达，并通过亲和和尺寸排阻色谱分离。SDS-PAGE分析确认共纯化（图1e），冷冻电镜显示直径约16 nm的颗粒（图1f）。无对称性（C1）的三维重构在十二面体结构内部产生显著密度，表明AaRS成功封装（图1g）。然而，客体冷冻电镜密度较弱且定义不清，特别是在预期的AaRS和AaLS之间的界面处，无法对其相互作用进行原子级解析。尽管测试了化学交联和各种重构策略（包括局部精修、对称性扩展和亚断层扫描平均），均未获得显著改善。持续较弱的客体密度表明AaRS在AaLS笼内存在构象异质性，而非结合到特定腔内位点。
通过对AaRS/AaLS复合物的冷冻电镜数据进行3D分类分析，我们发现相当大比例的颗粒由不完整的AaLS十二面体组成（补充图1和2）。这些结构缺少一到三个五聚体单元。相比之下，在相同条件下单独生产AaLS时，不完整组装体较少见。具体而言，当AaRS存在时，仅42%的颗粒被分类为完整的12五聚体组装体（补充图1a），而在无客体货物时这一比例为80%（补充图3a）。这些发现表明与AaRS共生产会阻碍AaLS笼体完成。
不完整AaLS组装体的存在促使我们研究AaRS是否可能与缺少五聚体构建模块的区域相互作用。由于该区域具有局部五重对称性，我们通过施加C5对称性对11五聚体颗粒进行了3D重构。该方法揭示了清晰定义的额外冷冻电镜密度，归因于AaRS的部分（图1h，红色，和补充图1b）。值得注意的是，该额外密度并非定位于腔内表面，而是位于AaLS五聚体-五聚体相互作用界面——即另一个五聚体对接后形成三重对称性的区域，以下称为"pre-C3"区域（图1i）。这种靶向正在组装的界面而非腔内表面的货物识别机制，在任何其他蛋白质区室中从未观察到。
同源三聚体AaRS呈现三个CLS肽，而五边形孔提供五个潜在的pre-C3结合位点，表明并非所有结合位点都会被等效占据。为解析AaRS的排列方式，我们对11五聚体颗粒应用了对称性扩展。所得密度图显示AaRS三聚体的两个CLS肽占据五边形孔的相邻角，而第三个CLS位于两者之间，不接触AaLS表面（图1j和补充图1b）。在10五聚体组装体中观察到相同构型（图1k和补充图1c）。两种复合物中相同的结合模式表明AaRS招募发生在组装早期阶段，捕获的10-和11五聚体颗粒代表笼体形成的相对丰富的晚期中间体。
五边形孔和AaRS三聚体的尺寸比较显示，客体货物需要完整笼体至少缺少三个五聚体才能通过开口（补充图4a，b）。这表明大多数AaRS招募发生在早期和中期组装阶段之间，与观察到AaRS三聚体结合到10-和11五聚体组装体一致。同时，如果AaRS未能预先三聚化，单个单体可通过较小的孔进入并在笼内三聚化（补充图4c），可能提供额外的化学计量控制层。
精修结构揭示了AaRS卷曲螺旋结构域作为主要组织单元的作用（图1l，m）。它跨越并将两个CLS肽引导至相邻的pre-C3结合位点，由此产生的多价性可能增强整体结合亲和力。为实现这种排列，两个CLS肽在与卷曲螺旋的连接处采用不同的二级结构构象。一个CLS与卷曲螺旋保持几乎连续的α-螺旋，而第二个CLS的连接子包含一个断裂以进行位置调整（图1m）。这种结构不对称性，特别是非螺旋连接子，将调节整体结合亲和力，使其足以锚定而不会在笼体完成期间完全阻断最终五聚体对接。
除CLS定位外，卷曲螺旋结构域还约束了腔内空间中三个催化结构域的空间排列。与CLS区域相比，催化结构域的冷冻电镜密度定义较差（补充图2），且未鉴定到与AaLS壳层的实质性接触。虽然卷曲螺旋呈现三重对称性，但催化结构域采用非对称排列（图1m），表明其结构域间连接具有柔性。这些观察共同表明催化结构域主要通过卷曲螺旋和CLS肽系留到锚定结构上。尽管存在这种柔性，完整的三聚体AaRS模型仍可可靠地拟合到可用密度中，证明锚定位点的空间容纳单个同源三聚体（图1l和补充图5）。值得注意的是，这种占据留下的多余体积不足以容纳另一个三聚体AaRS。这种由卷曲螺旋结构域施加的空间组织可能防止组装过程中的客体过载。
AaRS-CLS的相互作用模式
仔细检查冷冻电镜结构揭示了AaRS-CLS如何与AaLS五聚体界面结合（图2a–c）。AaRS-CLS采用两亲性α-螺旋，将氨基酸残基I200、F201、F204、L205和W207的侧链朝向由来自两个AaLS原体的L26、L121和I125组成的pre-C3疏水表面（图2b）。AaLS的E122通过笼组装体内侧的脂肪族部分封端疏水簇。在外侧，AaLS的R29残基通过阳离子-π相互作用与AaRS-CLS的W207结合。该R29残基也靠近AaRS的羧基末端，E122接近CLS的K197，可能形成盐桥。然而，这些静电相互作用可能是动态的。冷冻电镜密度无法确定这些氨基酸侧链带电部分的具体旋转异构体。
讨论与解读
冷冻电镜结构揭示了一套控制AaRS/AaLS包合物化学计量的分层机制（图5）。在组装早期，AaRS寡聚体通过其卷曲螺旋结构域展示多个CLS肽，而新生AaLS笼呈现多个pre-C3结合位点，实现多价相互作用，在动力学上有利于异源复合物形成而非空笼组装。此外，CLS锚定结合五聚体-五聚体界面的构象门控使笼体维持在瞬时开放状态，为完全客体装载提供充足时间，防止导致欠载组装体的过早闭合。相反，卷曲螺旋引导的腔内系留催化结构域空间排列通过物理阻断每笼容纳超过三个AaRS单体，防止了过载问题。十二面体完成后，热力学偏好和R29-E32分子锁防止五聚体释放，确保底物通道化和催化增强所需的持续封装。这些分层机制为3:1客体与笼化学计量的实现提供了分子层面的证明。
编译者解读：该研究最值得关注的是发现了货物识别靶向"正在组装的界面"而非腔内表面——这一机制在天然蛋白区室中前所未见。从合成生物学应用角度看，RS的CLS肽段和LS的pre-C3界面构成了一套模块化的"锁钥"系统，理论上可通过替换CLS序列将任意感兴趣的酶（或酶复合物）以可控化学计量封装进LS笼。不过，该策略目前依赖天然RS三聚体的空间占位来实现3:1比例，若要封装其他寡聚状态的货物，可能需要重新设计卷曲螺旋结构域的长度和对称性。此外，研究揭示的"延迟闭合"和"分子锁"概念也为设计响应式释放系统提供了灵感——例如通过环境触发分子锁的打开来实现货物受控释放。
PMID: 42143052