融合肽引导的催化活性包涵体

来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space

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导读

环境污染是全球疾病和过早死亡的重要诱因。酶法处理污染物是绿色生物修复的重要策略之一，但重组蛋白在 E. coli 中表达时常形成无活性包涵体。本研究设计了两株重组菌——表达野生型 CotA 漆酶的 Lac-17 与融合 35 氨基酸聚集肽的 Lac-40EL——后者自组装形成催化活性包涵体（CatIBs），酶活较前者最高提升 22 倍，4 °C 储存 3 个月活性不衰，在偶氮染料脱色中表现优异。该策略为漆酶的固定化与规模化应用提供了新路径。

研究背景

污染导致全球范围内疾病与过早死亡。目前有多种策略用于污染物处理，其中包括酶等生物方法。在 E. coli 中生产重组蛋白常导致目标蛋白聚集形成包涵体（IBs），这些包涵体富含目标蛋白。本研究开发了一种新策略：通过自组装在 E. coli 中生产固定化细菌漆酶——即催化活性包涵体（CatIBs）。目标蛋白为来自 Bacillus clausii 的外孢子壳蛋白 CotA，一种耐盐且 pH 稳定的漆酶，适用于废水处理等规模化应用。研究设计了两类构建体：Lac-17（无融合标签）和 Lac-40EL（C 端融合一段 35 氨基酸合成肽，命名为 40EL），均在 E. coli BL21(DE3) 中表达。

研究方法

编码序列、质粒与菌株的设计与构建

所选编码序列编码来自 Shouchella clausii（原名 B. clausii）的漆酶（CotA）（WP_011247492.1）。编码该漆酶的基因命名为 Lac-17，其开放阅读框因基因构建策略在 C 端延伸编码了两个额外氨基酸（Glu 和 Leu），作为克隆疤痕。在融合构建体 Lac-40EL 中，cotA 的开放阅读框进一步修饰，在 C 端编码了一段额外 35 氨基酸肽，该肽段设计用于促进蛋白聚集并辅助包涵体形成。所有合成序列均针对 E. coli 偏好密码子进行了优化 [71]。所得核苷酸序列由化学合成（GenScript Biotech，美国），每个基因构建体克隆至 pET15b 质粒（Novagen®，德国）。各质粒在 E. coli TOP10 细胞（Thermo Fisher Scientific，美国）中扩增，并使用 QIAprep® Spin Miniprep 试剂盒（Qiagen，德国）纯化。随后转化 E. coli BL21(DE3) 细胞，阳性克隆基于其对氨苄青霉素（100 µg/mL）的抗性进行筛选。阳性转化子保存在 30% 甘油中，于 -70 °C 储存 [45, 72]。E. coli BL21(DE3) 菌株用于异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导的 Lac-17 和 Lac-40EL 表达，二者均不带 His 标签。

E. coli 产 Lac-17 与 Lac-40EL 的摇瓶培养

细菌培养在 250 mL 锥形瓶（Duran Erlenmeyer flask，美国）中进行，每瓶含 50 mL Luria-Bertani 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素），接种 500 µL 重组 E. coli BL21(DE3) 工作管菌液，使用纱布和棉花自制瓶塞 [73]。重组 E. coli 的生长通过测量 600 nm 处光密度（OD）进行监测，OD 值依据先前建立的线性关系换算为细胞干重 [72, 73]。

培养至少设三次重复，起始条件为 30 °C、200 rpm，使用轨道摇床（New Brunswick Scientific C251，Eppendorf，美国），振动直径为 25 mm。当培养物在 600 nm 处达到约 0.6 吸光度单位（A.U.）（Spectronic Genesys 20，Thermo，美国）时，加入 0.1 mM IPTG（Merck-Millipore，Billerica, MA，美国）进行诱导；同时加入 0.25 mM CuSO₄。此时温度和转速分别降至 25 °C 和 120 rpm。诱导 4 小时后停止振荡，直至 22 小时培养结束 [26, 29, 37, 38]。培养期间在不同时间点取 1 mL 样品，通过离心（11,800 × g，10 min，10 °C）收集菌体。弃去上清，样品保存于 -20 °C [72, 73]。

蛋白回收与定量

为回收胞质蛋白，将细胞重悬于 300 µL 裂解缓冲液（50 mM Tris∙HCl、100 mM NaCl、0.1 mM PMSF，pH = 7）中，并在 SoniPrep150（Sanyo-Gallen-Kamp，英国）中超声处理，设置 10 个循环，每次 30 s 脉冲，振幅 10% [45, 72, 73]。为表征蛋白质含量，通过离心（11,800 × g）将可溶性蛋白提取物与不溶性蛋白（IP）组分分离。为通过 SDS-PAGE 鉴定蛋白谱，将总蛋白和 IP 组分溶解于 IEF 缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、40 mM DTT、2% w/v CHAPS）中。所有组分通过 SDS-PAGE（15%）在变性条件下分析，并用考马斯亮蓝 G-250 染色 [45, 72, 73]。可溶性组分和包涵体储存于 -20 °C [49, 50, 57]，随后用于酶活性测定。

蛋白浓度采用 Bradford 法测定，使用 Bio-Rad 试剂和 Stat-Fax 4200 酶标仪（Awareness Technology，美国），在 600 nm 处测量吸光度。校准曲线使用牛血清白蛋白（BSA）以 0 至 0.75 mg/mL 的浓度梯度生成。为定量总蛋白和包涵体，将其在 IEF 缓冲液中室温重悬 4 小时。不同蛋白组分的 SDS-PAGE 凝胶光密度分析使用 ImageLab v6.2 软件（BioRad，美国）进行。

包涵体的衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱分析

采用 ATR-FTIR 分析 Lac17 和 Lac-40EL 在诱导后 3 h 和 10 h 形成的包涵体的二级结构。包涵体预先在 SpeedVac Concentrator Savant ISS110（Thermo Fisher Scientific，美国）中干燥。光谱使用配备 Specac Quest ATR 金刚石附件的 Shimadzu IRAffinity-1 S FTIR 光谱仪（Shimadzu，日本）采集。包涵体在 1500–1700 cm⁻¹ 波数范围内进行分析。每个光谱采集 40 次干涉图，分辨率为 2 cm⁻¹，并取平均以提高信噪比 [45, 72, 73]。酰胺 I 区的二阶导数光谱在 LabSolutions IR 软件（Shimadzu）中使用 13 点平滑程序计算，以识别对应不同二级结构组分的频率 [72–76]。在比较分析前，以 1515 cm⁻¹ 处的酪氨酸带作为内参对光谱进行归一化 [45, 72, 73, 77]。ATR-FTIR 测量对每个条件使用三个独立培养的样品进行三次重复。

包涵体透射电子显微镜（TEM）图像分析

浓度在 0.3 至 0.5 mg/mL 之间的样品溶液按照 [77] 中描述的方法进行负染色。样品加载至 EMS 碳-铜网格上。使用乙酸铀酰（2.5% w/v）（Electron Microscopy Science）染色 30 s，直接吸去多余染液。随后，乙酸铀酰染色在装入样品架前过夜干燥。TEM 在 80 kV 下使用 ZEISS LIBRA 120 透射电子显微镜进行。图像由 GATAN CCD 记录，所得数据使用 Digital Micrograph 软件（Gatan, Pleasanton, CA）分析。

漆酶活性：ABTS 氧化

测定使用 200 µg 不溶性蛋白组分或 10 µg 可溶性蛋白组分。在这些测定中，0.2 mM ABTS 作为底物，溶于 500 µL 100 mM 柠檬酸/200 mM 磷酸盐缓冲液（pH 4）中，该 pH 值对应此底物的最大活性 pH，测定温度为 25 °C [26]。反应进程通过监测 420 nm 处吸光度变化进行跟踪 [26]。ABTS 的摩尔消光系数设为 ε420nm = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹ [78–80]。

染料脱色定性测定

为评估重组漆酶的染料脱色能力，向 96 孔板的每个孔中加入 200 µL 含 10 µg 不溶性组分或 1 µg 可溶性组分的反应介质。所评估的偶氮染料浓度为 200 mg/L，分别为 Eriochrome Black T 和 Congo Red。反应介质为合成纺织混合物（pH 8）和 100 mM Tris 缓冲液（pH 9）。在两种反应介质中均评估了乙酰丁香酮（0.1 mM）作为介体 [81]。合成混合物模拟纺织废水的典型化学特征（pH 8），含有高盐负荷和必需营养素 [82]。混合物组成（mg/L）：染料 200、(NH₄)₂HPO₄ 24、NH₄Cl 31、CaCl₂ 119.5、MgCl₂ 16.5、FeCl₃ 3.5、NaNO₃ 2.7、Na₂SO₄ 2,070、NaCl 26,000。

不产漆酶菌株的可溶性蛋白（命名为 HCP）和裂解缓冲液用作阴性对照（C-）。反应在室温下进行 12 h。处理效果通过 400 至 700 nm 之间的光谱扫描评估，样品预先在 11,800 × g 下离心 10 min。

分子建模

使用 B. clausii 漆酶 CotA 的氨基酸序列并附加肽段（40EL），通过 MMseqs2 [83] 生成深度多重序列比对。随后使用生成模型 Boltz-1 生成结构模型，该模型整合了（原文此处截断，未详述）。

研究结果

两株菌表现出相似的生长模式，但 Lac-17 产生更多的总重组蛋白（约 163 mg/L vs. 约 127 mg/L）。然而，Lac-40EL 形成的 CatIBs 酶活性较 Lac-17 最高提升 22 倍，尽管两种情况下约 85% 的重组蛋白均存在于不溶性组分中。结构模型表明，40EL 肽形成暴露的双 α-螺旋，促进有序聚集而不阻碍酶的活性位点。与可溶性组分不同，CatIBs 在 4 °C 下储存 3 个月后仍保持活性。在以 Eriochrome Black T 和 Congo Red 为底物的偶氮染料脱色实验中，Lac-40EL CatIBs 优于 Lac-17，尤其在存在氧化还原介体的情况下。

图1 展示了 Lac-17（A）和 Lac-40EL（B）在半对数坐标下的生长动力学（见插图）。所有培养均在含 50 mL LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）的 250 mL 锥形瓶中进行。培养条件在特定时间点进行修改，如箭头所示：（a）加入 0.1 mM IPTG 诱导并添加 0.25 mM CuSO₄，同时温度从 30 °C 降至 25 °C，转速从 200 rpm 降至 120 rpm；（b）开始 25 °C 静态培养阶段。产生漆酶 Lac-17（C）和 Lac-40EL（D）的重组菌株培养物中总蛋白（实心圆）、不溶性蛋白（空心圆）和可溶性蛋白（三角形）的动力学累积。蛋白定量采用 Bradford 法，基于三次独立生物学重复的测量。除测定总蛋白和不溶性蛋白组分外，还通过 50% IEF 缓冲液孵育 24 h 提取蛋白。SDS-PAGE 分离的蛋白谱动力学比较，来自产生漆酶 Lac-17（E，G，I）和 Lac-40EL（F，H，J）的重组菌株培养物中的总蛋白（E，F）、不溶性蛋白（G，H）和可溶性蛋白（I，J）。黑色箭头指示重组漆酶对应的条带。展示了诱导前采集的样品泳道，随后是诱导后 1、3、7、12 和 18 小时的泳道。标记为 MW 的泳道对应分子量标记。

图2 展示了重组漆酶蛋白 Lac-17（A）和 Lac-40EL（B）在培养物中总蛋白（实心圆）、不溶性蛋白（空心圆）和可溶性蛋白（三角形）中的动力学累积。重组漆酶蛋白 Lac-17（C）和 Lac-40EL（D）相对于生物量的动力学得率，包括总蛋白（实心圆）和不溶性蛋白（空心圆）。重组漆酶蛋白 Lac-17 和 Lac-40EL 的定量通过结合总蛋白浓度数据与 SDS-PAGE 中对应各蛋白条带的光密度分析完成。

图3 透射电子显微镜图像显示含漆酶蛋白包涵体（IBs）的细胞及包涵体 Lac-17（A）和 Lac-40EL（B）。还展示了分离的漆酶蛋白包涵体 Lac-17（C，E）和 Lac-40EL（D，F）。比例尺如图所示。直方图（G）展示了漆酶蛋白 Lac-17（虚线）和 Lac-40EL（实线）的包涵体尺寸分布。平均直径的分布在 Kolmogorov–Smirnov 检验中未显示显著差异（p < 0.05）。

图4 比较了 Lac-17（实心圆）和 Lac-40EL（空心圆）在可溶性（A，B）和不溶性（包涵体）组分（C，D）中的比活性，分别来自新鲜制备样品（A，C）和储存 3 个月的样品（B，D）。测定使用 200 µg 不溶性蛋白或 10 µg 可溶性蛋白，提取自诱导后不同时间点的培养物（0.1 mM IPTG 诱导并添加 0.25 mM CuSO₄）。反应在 25 °C 下搅拌进行三次重复，反应体积为 1 mL，含 0.2 mM ABTS（柠檬酸/磷酸盐缓冲液，pH 4），在 420 nm 处定量。

图5 比较了 Lac-17 和 Lac-40EL 在可溶性（A，C）和包涵体组分（B，C）中对 Eriochrome Black T 的降解（100 mM Tris，pH 9）。比较了 Lac-17 和 Lac-40EL 在可溶性（D，F）和包涵体组分（E，F）中对 Congo Red 的降解（100 mM Tris，pH 9）。比较了 Lac-17 和 Lac-40EL 在可溶性（G，I）和包涵体组分（H，I）中对 Congo Red 在合成混合物（pH 8）中的降解。反应在微孔板中重复进行两次，反应体积为 200 µL，含 1 µg 可溶性组分或 10 µg 包涵体。染料浓度为 200 mg/L，乙酰丁香酮浓度为 0.1 mM。−AS = 不添加乙酰丁香酮，+AS = 添加乙酰丁香酮。样品在目视分析前以 11,800 × g 离心 10 min。定量比较使用 626 nm 处的吸光度值。C-（未处理样品）为不含蛋白的反应。HCP 为含等量来自不产漆酶 E. coli 蛋白的反应。处理间显著差异（p < 0.05）以柱上方不同小写字母表示。

图6 B. clausii 漆酶蛋白（CotA）C 端融合 40 氨基酸肽段（40EL）的三维模型。Lac-40EL 的预测结构包含四个铜离子配位位点，这一特征与 B. subtilis 漆酶（PDB ID 1GSK [30]）的实验测定结构一致，后者在所有已解析结构的漆酶中与 B. clausii 漆酶具有最高的序列同一性（59.3%）。图中还展示了 Boltz-1 生成的聚集肽前 20 个排名构象中两个聚类的代表性质心。

图7 Lac17（虚线）和 Lac-40EL（实线）样品的 FTIR 光谱比较。Lac17 和 Lac-40EL 的 FTIR 光谱记录自诱导后 3 h（A）和 10 h（B）采集的样品。所示光谱为三次独立生物学重复的平均值。比较聚焦于酰胺 I 区（1700–1500 cm⁻¹）的差异，突出二级结构特征的差异。

讨论与解读

本研究证明，理性肽段设计可通过 CatIBs 形成改善酶的固定化、活性和稳定性。所得 CatIBs 自组装高效、易于回收，并表现出操作稳定性，支持其在纺织废水处理中规模化生产和新型应用的潜力。

编译者解读

本研究巧妙地将"包涵体"这一传统上被视为重组蛋白生产副产物的结构转化为功能性固定化酶平台。融合 35 氨基酸聚集肽的策略值得关注——它不依赖传统固定化载体，通过自组装一步完成酶的固定化，同时显著提升酶活与储存稳定性。从合成生物学应用角度看，该方法规避了繁琐的体外固定化步骤，降低了生产成本，尤其适合大规模废水处理场景。不过，CatIBs 的催化效率仍低于可溶性酶，且 85% 重组蛋白以不溶性形式存在，这意味着单位生物量的总催化通量仍有优化空间。未来若能进一步优化肽段序列以平衡聚集效率与底物可及性，该平台在工业生物催化中的潜力将更加可观。

参考来源

Romero-Martínez D, Gasteazoro F, Cofas-Vargas LF, et al. Catalytically active inclusion bodies of Bacillus clausii laccase protein recombinantly produced in E. coli for dye decolorization. Microb Cell Fact. PMID: 41792773. DOI: 10.1186/s12934-026-02949-4.

PMID: 41792773