来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
一株经过多模块平衡改造的库德毕赤酵母（Komagataella phaffii），在5升发酵罐中经过204小时高密度发酵，将黑素前体尿黑酸产量提升66倍，并进一步通过氧化聚合合成出焦黑素——最高产量达到70.5 ± 0.7 g/L。这项研究发表在Nature Communications上，为焦黑素的工业化生物制造提供了一条完整的技术路径。
天然来源的焦黑素产量低，提取成本高。微生物合成被视为可持续且经济可行的替代方案。但如何在高产与聚合之间找到平衡，一直是该领域的难点。Zhu等人给出的答案是：先用代谢工程把尿黑酸产量拉上去，再通过两种不同的氧化聚合方式获得焦黑素，最后用5升发酵罐验证工业化潜力。
研究背景
焦黑素是一种深色色素，在多个领域已有广泛应用。它属于黑素家族，由尿黑酸（homogentisic acid, HGA）经氧化聚合形成。自然界中某些细菌和真菌能合成焦黑素，但天然菌株的产量普遍偏低，难以满足工业需求。代谢工程改造微生物，被认为是解决这一瓶颈的可行路线。
K. phaffii（旧称毕赤酵母）是工业上成熟的外源蛋白表达宿主，具备完善的甲醇利用途径和高密度发酵工艺。该菌株本身拥有尿黑酸的天然合成通路，但催化效率不高。本研究的目标很明确——通过多模块平衡、酶工程改造和发酵工艺优化，把这条通路的产能充分释放出来。
研究方法
菌株与质粒构建。 研究以K. phaffii GS115为宿主菌，Escherichia coli TOP10F'用于质粒构建与扩增，E. coli BL21(DE3)用于蛋白表达。基因过表达整合选用pZACH质粒，采用Cre/loxP ZeoR标记循环回收方法保证每次整合的遗传稳定性。基因敲除使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达与纯化使用pET-28a质粒。来自粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）的羟苯基丙酮酸双加氧酶基因（AfHPPD）和来自解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的酪氨酸转氨酶基因（YlTYRB）经密码子优化后由Generay公司合成。
培养基与培养条件。 大肠杆菌使用LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl），37°C培养。重组酵母分别使用YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）和BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）进行培养。
尿黑酸生物合成通路的构建。 研究人员首先测试了野生型菌株的尿黑酸生产能力，随后逐步引入外源关键酶基因。通过多拷贝整合策略，将AfHPPD基因整合至基因组的不同位点（HIS4、INT1、INT18），构建系列工程菌株。在这一过程中，还建立了基于色素颜色的筛选系统，利用尿黑酸自发氧化聚合产生的颜色变化作为筛选标记。
酶工程改造。 研究团队将颜色筛选系统应用于3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHPS）的定向进化，以及羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）的半理性设计改造。具体突变位点和筛选轮次，原文摘要未详述具体参数。
焦黑素合成。 尿黑酸通过氧化聚合生成焦黑素。研究比较了两种聚合方式：碱性条件下的氧化聚合和漆酶（laccase）处理下的酶促聚合。两种方式得到的焦黑素在性质上存在差异。
高密度发酵。 在5升发酵罐中进行高密度发酵，发酵时长204小时。发酵过程中的具体参数（温度、pH、转速、溶氧、甲醇流加策略等），原文摘要未详述具体参数。
研究结果
野生型菌株的尿黑酸产量极低。 摇瓶发酵5天后，野生型菌株的尿黑酸产量仅为25 ± 0.85 mg/L，上清液无明显颜色变化，OD400仅为0.006。向培养基中添加不同浓度的L-酪氨酸，尿黑酸产量并未显著提升。这说明K. phaffii内源的HPPD和TYRB酶催化效率低下，是通量瓶颈所在。
外源酶筛选与多拷贝整合显著提产。 引入AfHPPD和YlTYRB后，尿黑酸产量明显提升。其中，AfHPPD过表达对产量的促进作用大于YlTYRB，印证了文献中关于HPPD是尿黑酸合成通路关键酶的观点。进一步通过多拷贝整合优化AfHPPD表达，菌株Pyo9在基因组三个不同位点（HIS4、INT1、INT18）整合了三份AfHPPD拷贝，尿黑酸产量达到64.1 ± 0.68 mg/L。与野生型相比，该菌株上清液呈现更深的浅棕色，OD400升至0.362，这归因于尿黑酸的自发氧化聚合。
代谢模块平衡实现66倍增产。 通过平衡三条不同的生物合成模块，工程菌株的尿黑酸产量最终提升了66倍。原文摘要未提供各模块的具体贡献比例和最终菌株的摇瓶产量数值，但指出这一平衡策略是产量跃升的核心。
焦黑素合成与性质差异。 研究报道了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理两种方式所得焦黑素的差异。原文摘要未详述两种焦黑素在结构、分子量或光学性质上的具体差异数据。
5升发酵罐验证。 经过204小时高密度发酵，菌株Pyo29实现最高产量70.5 ± 0.7 g/L。这是本研究中报告的最高焦黑素产量数据。
应用潜力展示。 研究最后展示了焦黑素的潜在应用价值。原文摘要未详述具体的应用测试内容，但明确指出焦黑素具有实质性工业生产的应用前景。
讨论与展望
这项研究的价值在于把"从甲醇到焦黑素"的完整链条打通了。甲醇是廉价的碳源，K. phaffii是工业界熟悉的生产宿主，尿黑酸产量66倍的提升和70.5 g/L的最终产量，让焦黑素的生物制造从实验室走向中试成为可能。
一个值得注意的设计思路是颜色筛选系统的建立。尿黑酸自发氧化聚合产生颜色变化，这一特性被转化为筛选工具，用于DAHPS的定向进化和HPPD的半理性设计。这种"以产物自身性质为筛选压力"的策略，避免了繁琐的色谱检测，大幅提高了筛选通量。该研究选择碱性氧化聚合和漆酶处理两种方式合成焦黑素，并报道了产物差异，可能与其下游应用场景的多样化需求有关——不同聚合方式产生的焦黑素在结构和性质上可能存在差异，适用于不同用途。
需要指出的是，原文摘要未提供酶工程改造的具体突变位点、两种聚合方式的详细表征数据以及发酵工艺参数。这些细节对于工业放大至关重要，期待后续研究能补充完整。总体而言，这项研究为焦黑素乃至其他黑素类色素的高产生物制造提供了一个可复制的技术范式。
参考来源
Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nat Commun. PMID: 41839868.
PMID: 41839868