系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高效生产L-异亮氨酸

📅 2026-08-12 📰 J Anim Sci Biotechnol 2026 Jul 8 📂 研究进展 👁 17

来源：J Anim Sci Biotechnol | 编译：DNA Lab Space

导读

L-异亮氨酸是畜禽必需的支链氨基酸，参与蛋白质沉积与能量代谢调控。本研究整合生物传感器辅助ARTP诱变、结构引导蛋白质工程与模块化途径重排，构建了高产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株cgl-Ile8。5-L发酵罐中产量达48.49 g/L，50-L放大后进一步升至50.12 g/L，为目前报道的谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸最高产量。

研究背景

L-异亮氨酸是畜禽必需的支链氨基酸，支持蛋白质沉积，并调节能量代谢、免疫功能与应激抵抗力。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为公认安全（GRAS）的工业氨基酸生产菌株，已被广泛用于多种氨基酸的发酵生产。然而，L-异亮氨酸的生物合成途径较长，涉及多个关键酶催化的限速步骤，且受反馈抑制调控，导致其产量长期低于其他支链氨基酸。如何系统性地解除代谢瓶颈、增强前体供给并优化发酵条件，是构建高效L-异亮氨酸生产菌株的核心问题。

研究方法

菌株、质粒与引物

本研究所用菌株、质粒及引物列于补充表S1和S8。基因组整合位点、异源基因、基因工程靶点及用于途径构建的启动子组汇总于补充表S2–S7。以C. glutamicum ATCC 13032为出发菌株进行随机诱变以产生生产候选菌株，从中筛选出L-异亮氨酸生产底盘菌株。E. coli DH5α用于常规质粒扩增与载体构建。自杀载体pK18mobsacB用于染色体基因编辑。

基因组操作

C. glutamicum的基因组编辑使用pK18mobsacB衍生自杀载体，该载体携带突变或目标片段，两侧为约1,000 bp的同源臂。对于染色体修饰，将1 μg相应质粒（如pK18-thrABC）通过电穿孔导入C. glutamicum，通过两步同源重组获得突变体。具体操作如下：转化子在含卡那霉素（25 μg/mL）的LBGB琼脂平板上筛选，富集单交换整合子。随后将重组菌在不含卡那霉素的LBGB培养基中培养4 h，梯度稀释后涂布于含10%（w/v）蔗糖的LBGB琼脂平板，以分离双交换突变体。候选菌落经菌落PCR和Sanger测序确认。

EcTD(P441F)突变体表达菌株的构建

所用质粒及突变引物序列分别列于补充表S1和S8。EcTD(P441F)突变体通过全质粒PCR定点突变法构建。简要流程：以重组质粒为模板进行PCR扩增；扩增产物纯化后用DpnI消化30 min，去除甲基化亲本质粒DNA；消化产物通过化学转化法转入化学感受态E. coli BL21 (DE3)细胞，转化子培养后用于后续实验。

生物传感器的构建与表征

以C. glutamicum ATCC 13032基因组DNA为模板，用DNA聚合酶及相应引物对（列于补充表S7）PCR扩增lrp基因和brnEFN7启动子。报告基因gfp通过基因合成获得。将lrp、PbrnEFN7和gfp片段分别通过同源重组方法（AB克隆酶，按制造商说明书操作）组装至质粒骨架pECXK99E、pXMJ19和pZK001中，生成生物传感器质粒pECXK99E-SensorIle、pXMJ19-SensorIle和pZK001-SensorIle。

三个构建体均含有相同的传感模块（由lrp、PbrnEFN7和gfp组成），区别在于质粒骨架不同。具体而言，pECXK99E提供相对简单的表达背景，常用于C. glutamicum单基因表达；pXMJ19提供适合相对更强、更灵活基因表达的穿梭载体背景；pZK001为实验室构建的质粒，用作比较的替代骨架。因此，三种生物传感器构建体因载体背景差异而预期表现出不同的传感性能。

重组质粒在用于后续生物传感器评估前经菌落PCR和Sanger测序验证。为表征生物传感器，将携带不同构建体的菌株在相同实验条件下培养，在一系列L-异亮氨酸浓度下测定其荧光响应。根据响应强度和响应范围比较生物传感器性能。三种构建体中，pECXK99E-SensorIle表现出最佳传感性能，因此被选用于后续筛选。

常压室温等离子体（ARTP）诱变

使用自动化常压室温等离子体（ARTP）诱变系统（无锡思清源生物科技有限公司）对野生型C. glutamicum ATCC 13032进行随机诱变。以氦气为工作气体产生等离子体射流。喷嘴到样品距离保持2 mm，氦气流量设为10 L/min，射频功率固定为100 W。为确定最佳处理时间，在一系列处理时长下评估C. glutamicum ATCC 13032的致死率。简要操作：取10 μL新鲜制备的对数期细胞悬液均匀涂布于无菌金属板上，分别暴露于ARTP射流80、100、120、140或160 s。处理后，将金属板转移至含1 mL无菌蒸馏水的无菌微量离心管中，立即重悬细胞。悬液梯度稀释后涂布于固体培养基，30 °C培养48 h。致死率计算公式为：

致死率(%) = [(C − S) / C] × 100

其中C为未处理对照的平均菌落数，S为ARTP处理样品的平均菌落数。菌落数通过菌落形成单位（CFU）测定法进行两次重复计数。

突变菌株遗传稳定性测试与筛选

15代遗传稳定性评估的详细操作流程如下：

种子培养：将菌株cgl-Ile0在LBGB固体培养基上30 °C活化24 h，挑取单菌落接种至50 mL LBGB液体培养基中，30 °C、220 r/min培养12 h获得种子液。

连续传代：取1 mL种子液接种至50 mL新鲜LBGB液体培养基（接种量2%，v/v），相同条件下培养至对数生长期（OD600 ≈ 1.0–1.2），定义为一代。重复此操作连续传代15代。

稳定性检测：分别在第1、5、10和15代后，将菌株接种至L-异亮氨酸发酵培养基中，30 °C、220 r/min培养36 h。测定各代的L-异亮氨酸产量和细胞生长量，以验证突变菌株的遗传稳定性。

全基因组测序与数据分析

对突变菌株cgl-Ile0进行全基因组重测序以鉴定突变位点。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，DNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳评估。Illumina双端（PE）文库构建及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

生物信息学分析流程：使用fastp对原始读段进行修剪和质量过滤，去除低质量序列。使用BWA-MEM算法将干净读段比对至亲本C. glutamicum ATCC 13032参考基因组。使用Picard MarkDuplicates去除PCR重复。基于所得BAM文件，使用SAMtools计算测序深度和基因组覆盖度。使用Snippy鉴定变异，随后基于测序深度和比对质量进行过滤。保留的变异使用SnpEff进行功能注释，预测其潜在基因组效应。

蛋白质表达与纯化

野生型及工程改造的TD和AHAS酶在E. coli BL21 (DE3)中过表达。细胞在含卡那霉素（50 μg/mL）的30 mL LB培养基中37 °C培养至OD600为0.6–0.8。加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.42 mmol/L诱导蛋白质表达，随后25 °C孵育14 h。细胞通过离心（4,629 × g，10 min）收获。

▲ Construction of isoleucine biosensors and high-throughput screening of mutagenic strains. a Construction and optimization of the isoleucine biosensor pSenIleBP. b Screening of high-producing strains based on HTS platform. c Identification of key mutant genes in mutagenic strain cgl-Ile0. OAA, oxaloa

▲ Screening and protein engineering of threonine dehydratase. a Screening of threonine dehydratase. Bc TD, threonine dehydratase derived from B. cereus ; Bt TD, threonine dehydratase derived from B. thuringiensis ; Bs TD, threonine dehydratase derived from B. subtilis ; Cg TD, threonine dehydratase de

▲ 乙酰羟酸合酶的筛选与蛋白质工程。a 乙酰乳酸合酶的筛选。Pa AHAS，来源于铜绿假单胞菌的乙酰乳酸合酶；Ec AHAS，来源于大肠杆菌的乙酰乳酸合酶；Kp AHAS，来源于肺炎克雷伯菌的乙酰乳酸合酶；Sm AHAS，来源于粘质沙雷菌的乙酰乳酸合酶；Mt AHAS，来源于结核分枝杆菌的乙酰乳酸合酶。b 乙酰乳酸合酶及其突变体的反馈抑制耐受能力。c 乙酰乳酸合酶蛋白质结构分析。d 乙酰乳酸合酶的分子对接。

研究结果

通过生物传感器辅助ARTP诱变获得遗传稳定的L-异亮氨酸生产菌株C. glutamicum cgl-Ile0，在5-L发酵罐中L-异亮氨酸产量为11.52 g/L，得率为0.11 g/g，生产强度为0.24 g/L/h。全基因组重测序揭示了与表型相关的四个突变，包括aspBV346I、asdP27E、brnEL87S和brnFR28P。

对两个限速酶——苏氨酸脱水酶（TD）和乙酰羟酸合酶（AHAS）——进行结构引导的蛋白质工程改造，获得菌株cgl-Ile1，相对于菌株cgl-Ile0，产量、得率和生产强度分别提高39.50%、27.27%和37.50%。

随后对L-异亮氨酸生物合成模块、草酰乙酸供给模块、辅因子供给模块和转运/外排模块进行模块化优化，获得最终菌株cgl-Ile8。通过优化pH和溶解氧，菌株cgl-Ile8在5-L发酵罐中L-异亮氨酸的产量、得率和生产强度分别为48.49 g/L、0.31 g/g和1.01 g/L/h，分别是菌株cgl-Ile0的4.21倍、2.82倍和4.21倍。

放大至50-L发酵罐后，产量、得率和生产强度进一步增至50.12 g/L、0.32 g/g和1.04 g/L/h，为目前报道的C. glutamicum中L-异亮氨酸最高产量。

▲ Modular engineering of strain cgl-Ile1. a The synthetic metabolic pathway of isoleucine. Glc, glucose; PEP, phosphoenolpyruvate; Ac-CoA, acetyl coenzyme A; OAA, oxaloacetate; Asp, aspartate; Asp-P, aspartate-phosphate; Asp-SA, aspartate-semialdehyde; Hom, homoserine; Hom-P, homoserine-phosphate; Tha

▲ 菌株cgl-Ile8发酵工艺优化。a 菌株cgl-Ile8在5-L发酵罐中的发酵过程。b 菌株cgl-Ile8发酵过程中pH的优化。c 菌株cgl-Ile8发酵过程中溶解氧水平的优化。统计学显著性以* P < 0.05、** P < 0.01和*** P < 0.001表示。数值和误差棒代表三次生物学重复的平均值和标准差。

讨论与解读

本研究将生物传感器引导的ARTP诱变、结构引导的蛋白质工程和模块化途径重排相结合，成功构建了工业化L-异亮氨酸生产菌株。生物传感器辅助筛选有效缩短了突变株的筛选周期，全基因组重测序精准定位了关键突变位点。结构引导的蛋白质工程针对TD和AHAS两个限速酶进行改造，有效缓解了反馈抑制。模块化代谢工程系统性地增强了前体供给和辅因子再生，而发酵过程优化进一步释放了菌株的生产潜力。50-L发酵罐中50.12 g/L的产量证实了该策略的工业可行性。

编译者解读

本研究展示了合成生物学"设计-构建-测试-学习"闭环在氨基酸工业生产中的典型应用。值得关注的是，生物传感器与ARTP诱变的结合实现了无需先验知识的高通量菌株筛选，而结构引导的蛋白质工程则提供了理性改造限速酶的新范式。从11.52 g/L到50.12 g/L的产量跃升，体现了多策略叠加的协同效应。局限在于，50-L规模的放大仍需验证更大体积发酵罐中的传质与传氧效果，且部分突变位点的具体调控机制仍有待深入阐明。该框架对其它支链氨基酸及GRAS微生物生产菌株的构建具有直接参考价值。

参考来源

Cao J, Huang M, Sheng Q, Zhang L, Meng G. Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for efficient production of L-isoleucine. J Anim Sci Biotechnol. PMID: 42415166. DOI: 10.1186/s40104-026-01459-y.

PMID: 42415166

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