来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理产生的低pH、高温及发酵抑制物等严苛条件对微生物宿主构成严峻挑战。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母Issatchenkia orientalis为宿主，基于其内源SED1基因构建了可在该酵母中发挥功能的细胞表面展示系统，成功实现了荧光蛋白和β-葡萄糖苷酶的表面展示，所得菌株能在纤维二糖为唯一碳源甚至在发酵抑制物存在下稳健生长，为木质纤维素生物转化提供了新的工业平台。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了对非化石基可持续生产体系的迫切需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业废弃物——因其储量丰富且不与粮食作物竞争，成为最具前景的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，前两者经化学和酶处理可水解为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等可发酵单糖，进而由代谢工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母因具有抗噬菌体感染、遗传操作简便、异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化的理想宿主。然而，大多数模式酵母（如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构域将纤维素酶展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的酸性热化学预处理会形成低pH、高温及抑制物并存的严苛培养条件，因此展示纤维素酶的宿主菌株必须具备对这些胁迫的卓越耐受性。本研究选用具有显著多胁迫耐受性的非常规酵母Issatchenkia orientalis，旨在建立适用于该酵母的细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌NovaBlue菌株（Novagen, WI, USA）作为重组DNA操作宿主，其转化子在添加100 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）中于37 °C培养。本研究所用I. orientalis野生型菌株共11株，购自日本NITE生物资源中心（NBRC, Tokyo, Japan）；酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies, CA, USA）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母培养基为YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto-peptone [Difco Laboratories, MI, USA]、20 g/L葡萄糖）、缺尿嘧啶的SC dropout培养基（SC-URA）（6.7 g/L无氨基酸酵母氮碱基 [Difco Laboratories]、1.92 g/L无尿嘧啶酵母合成dropout培养基补充物 [Sigma-Aldrich, MO, USA]、20 g/L葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮碱基 [Difco Laboratories]、20 g/L葡萄糖）。
I. orientalis NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将I. orientalis和S. cerevisiae细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl调至2、用0.5 M KOH调至6。培养在L形管中进行，使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC, Tokyo, Japan）于30 °C或45 °C、40 rpm条件下振荡培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香草醛）的耐受性，细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600分别为1、0.1、0.01、0.001），各取3 µL点样于添加了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香草醛10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，使用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics, Tokyo, Japan）记录菌落生长。
I. orientalis NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka, Osaka, Japan）提取I. orientalis NBRC1664基因组DNA。分别以URA3-UP-F/URA3-UP-R引物和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R引物（Xiao et al. 2014）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂。两片段经重叠延伸PCR融合，所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在添加1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。通过菌落PCR（引物Colony-P-F和Colony-P-R）确认IoURA3 ORF的删除。为验证尿嘧啶营养缺陷型，将转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线并于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio, Shiga, Japan）按制造商说明书构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
以URA3-F和Colony-P-R引物通过PCR从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IoURA3基因片段，将其导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，所得质粒命名为pVT。以ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR从质粒pleGFP-SSS（Inokuma et al. 2020）扩增增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达盒，导入pVT的SacI位点，所得质粒命名为pVT-SceGFP。
以IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物通过PCR从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增去除分泌信号肽编码序列的IoSED1编码区（表S4）。该片段与以Vector-F和Vector-R引物、以质粒plBG-SSS（Inokuma et al. 2016）为模板经PCR产生的DNA片段融合，所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定结构域被IoSED1锚定结构域替代。含IoSED1启动子、分泌信号和锚定结构域的eGFP展示质粒构建如下：以IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物从I. orientalis NBRC10737基因组DNA经PCR扩增含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段；以eGFP-F和eGFP-R引物从pleGFP-SSS经PCR扩增eGFP编码区DNA片段；以IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物从plBG-SSIoS经PCR扩增编码IoSED1锚定结构域的DNA片段。三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入I. orientalis NBRC1664染色体2已知基因间位点IS2（Lee et al. 2022）的整合型质粒构建如下：分别以IS2-UP-F/IS2-UP-R引物和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R引物从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IS2上下游各约1 kbp的DNA片段。在IS2-UP-R的重叠区域插入PacI识别位点。两片段经重叠延伸PCR融合，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。以IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR从pVT-IoeGFP扩增eGFP展示基因表达盒，导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于展示A. aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：分别以IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2引物和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2引物从pVT-IoeGFP扩增IoSED1启动子和分泌信号片段及IoSED1锚定结构域片段。以BGL-F和BGL-R引物通过PCR从plBG-SSS扩增编码A. aculeatus BGL1的DNA片段。三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的I. orientalis菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别获得16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT同样导入NBRC1664/ura3Δ菌株，获得16-pVT菌株。为实现eGFP展示盒的基因组整合，整合型质粒pVT-IS-IoeGFP经PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的I. orientalis菌株，整合型质粒pVT-IS-IoBGL经PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoBG-int菌株。
所有I. orientalis菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照Xiao et al.（2014）并略作修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养，取适量接种至3 mL新鲜YPD培养基中继续培养。
研究结果
I. orientalis NBRC1664多胁迫耐受性评估
为比较I. orientalis与模式酵母S. cerevisiae的多胁迫耐受性，本研究评估了从NBRC获得的11株I. orientalis菌株中耐受性最强的NBRC1664（图S1）与S. cerevisiae BY4741在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的生长表现。如图1a所示，两种菌株在pH 6下均生长良好，但I. orientalis的生长优于S. cerevisiae。I. orientalis在pH 2下表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同，而S. cerevisiae在pH 2下完全无法生长。类似地，在45 °C下I. orientalis成功生长而S. cerevisiae不能；两种菌株在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。
进一步地，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香草醛）存在下的生长情况，进行了点板实验（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的浓度范围内（Mills et al. 2009）。在添加适当营养物的SD培养基非胁迫条件下，两种菌均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis在三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而S. cerevisiae在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上结果表明，I. orientalis NBRC1664具有卓越的多胁迫耐受性。
展示eGFP的I. orientalis菌株评估
为确定与GPI锚定结构域融合的蛋白能否固定在I. orientalis细胞表面，本研究构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达先前已证明可在S. cerevisiae细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma et al. 2020），该表达盒由S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定结构域以及S. cerevisiae SAG1终止子组成（图2a）。携带该表达盒的附加型质粒（pVT-SceGFP）被导入I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株（其尿嘧啶营养缺陷型已通过生长分析确认，图S2），并按"材料与方法"所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
随后，本研究假设荧光缺失源于异源遗传元件在I. orientalis中功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定结构域对展示效率具有关键影响（Inokuma et al. 2014, 2016；Zhang et al. 2013）。因此，构建了一个修饰型展示盒，其中每个元件均被替换为IoSED1基因的相应元件（图2a）。IoSED1与ScSED1基因同源（Kitagawa et al. 2010），且根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber et al. 2004）被预测编码GPI锚定蛋白。此外，源自IoSED1基因的信号序列已被报道可介导靶蛋白的胞外分泌（Kitagawa et al. 2010）。将这一新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察显示清晰的表面定位荧光（图2b）。该荧光模式与展示eGFP的S. cerevisiae菌株中观察到的模式相当（Inokuma et al. 2020），表明eGFP成功展示于I. orientalis细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅有少数细胞显示荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，将展示盒整合至基因组。按"材料与方法"所述构建了设计用于将表达盒插入I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee et al. 2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，显示清晰表面定位信号的细胞比例大幅增加（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综合而言，这些结果证明成功构建了能够在I. orientalis细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的I. orientalis菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，构建了展示A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao et al. 1988）的I. orientalis菌株，命名为16-IoBG-int（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h后，在30 °C下分别评估细胞组分和培养上清液中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清液中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL成功展示于I. orientalis细胞表面。
此外，为评估展示的A. aculeatus BGL1在LCB生物转化预期高温条件下的活性（Yanase et al. 2010），将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著增加至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与A. aculeatus BGL1的最适温度处于50 °C以上的高温范围这一事实一致（Murao et al. 1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的BGL展示菌株能否在实际应用中利用纤维二糖，本研究进行了以纤维二糖为唯一碳源的培养实验。
讨论与解读
本研究开发了适用于多胁迫耐受酵母I. orientalis的细胞表面展示盒，并利用该展示盒成功构建了在细胞表面展示A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的I. orientalis菌株非常适合高效的LCB生物转化。
本研究通过采用源自IoSED1基因的启动子、分泌信号和锚定结构域构建了新的基因表达盒，并成功展示了eGFP。研究发现，与附加型质粒表达系统相比，展示盒的基因组整合显著提高了细胞表面呈现eGFP荧光的细胞比例，表明质粒型表达在I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。这一解释得到先前报道的支持——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的附加型质粒在另一株I. orientalis菌株中也表现出不稳定性（Tran et al. 2019；Cao et al. 2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍可观察到一部分无荧光细胞。值得注意的是，如图2b所示，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光。
编译者解读
本研究的技术路线具有清晰的"问题驱动"特征——并非简单地将酿酒酵母展示系统移植到新宿主，而是系统性地识别了异源遗传元件在I. orientalis中的功能失效，并基于内源IoSED1基因重新设计展示盒，体现了合成生物学中"宿主适配"的核心理念。基因组整合策略有效规避了附加型质粒在该非常规酵母中的不稳定性，这一经验对在其他非模式酵母中建立展示系统具有直接借鉴价值。BGL展示菌株在45 °C下酶活较30 °C提升3倍以上，且能在抑制物存在下同化纤维二糖，展示了"酶展示+多胁迫耐受"整合策略在同步糖化发酵中的潜力。局限在于，目前仅验证了单酶展示，纤维素的完全水解需要多种酶协同作用，多酶共展示将是后续值得探索的方向。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235