来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母基因编辑的卡脖子环节往往不在切割本身，而在向导RNA（sgRNA）的构建。传统的限制酶切-连接克隆既耗时又容易失败，每次更换靶点都意味着新一轮的酶切、纯化和连接。这篇发表于《STAR Protocols》的方案打破了这一瓶颈——用PCR扩增直接完成sgRNA的安装，让向导迭代变得像换引物一样简单。
研究背景
CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的应用已相当成熟，但多数protocol仍依赖限制性内切酶和DNA连接酶将sgRNA克隆入表达质粒。这一步骤不仅操作繁琐，而且当研究者需要同时测试多个向导RNA或对多个位点进行编辑时，每一轮克隆都成为显著的瓶颈。
该方案的核心创新在于：用PCR产物直接替换传统的酶切-连接步骤，将sgRNA安装到Cas9质粒上，同时在质粒骨架中引入短的同源序列，使载体在大肠杆菌内完成克隆和验证后，能够通过无缝循环化（recircularization）恢复质粒结构。这种设计既保留了G418（Geneticin）抗性标记（KanMX）用于酵母筛选，又避免了反复的酶切操作。论文作者Rostamian等人将这一流程完整呈现，从sgRNA和HDR供体设计、PCR引导插入、大肠杆菌克隆验证，到酵母的醋酸锂/PEG共转化，每一步都有明确的实验参数。
研究方法
培养基配制——从LB到YPD的完整体系
方案首先提供了四种培养基的精确配方。LB液体培养基（含卡那霉素）以25 g/L的预混合LB肉汤粉末为基础，加入ddH₂O定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟，冷却至约55°C后加入无菌过滤的卡那霉素储存液（50 mg/mL），使终浓度为50 μg/mL（即每升加1 mL储存液）。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存长达6个月，含卡那霉素的LB液体培养基则需在4°C保存，期限为1个月。
LB琼脂平板（含卡那霉素）在液体配方基础上额外加入15 g Bacto琼脂（终浓度1.5% w/v），121°C灭菌至少20分钟，冷却至约55°C后加入卡那霉素并轻轻旋动混匀（避免产生气泡），倒入无菌培养皿，室温凝固后倒置，4°C保存于标记好的封口袋中，同样以1个月为限。
YPD液体培养基的配方为：葡萄糖（右旋糖）10 g（2% w/v）、蛋白胨10 g（2% w/v）、酵母提取物5 g（1% w/v），ddH₂O定容至500 mL。先在约400 mL ddH₂O中溶解试剂，再补足至500 mL，121°C灭菌15–20分钟。灭菌后的YPD液体培养基可在室温保存长达6个月。
YPD琼脂平板（含G418）在液体配方基础上加入10 g Bacto琼脂（2% w/v），灭菌后加入G418储存液（50 mg/mL）5 mL，使终浓度为500 μg/mL。原文摘要未详述该平板灭菌后的具体冷却温度，但操作逻辑与其他培养基一致。
sgRNA与HDR供体设计
方案要求针对目标位点设计单导向RNA（sgRNA），同时设计同源定向修复（HDR）供体DNA。供体设计中包含了沉默突变以破坏PAM序列——这是防止编辑后Cas9再次切割的关键策略。原文摘要未详述sgRNA的具体长度选择标准或供体同源臂的最适长度，但明确指出了供体应携带预期的编辑序列（包括缺失、插入或点突变）以及PAM破坏突变。
PCR引导的sgRNA插入与质粒循环化
与传统酶切-连接不同，该方法通过PCR扩增将sgRNA片段直接安装到KanMX/G418筛选标记的Cas9-sgRNA质粒上。PCR引物设计时在片段两端引入与质粒插入位点两侧同源的序列（原文摘要未给出具体同源臂长度），使得PCR产物能够通过同源重组的方式替换原有的sgRNA序列。同时，质粒骨架中预设的短同源序列使载体在安装sgRNA后能够无缝循环化，无需连接酶参与。原文摘要未详述PCR扩增的具体循环参数、退火温度或聚合酶品牌。
大肠杆菌中的质粒克隆与序列验证
PCR产物转化进入大肠杆菌后，在含卡那霉素的LB培养基上进行筛选。由于质粒携带卡那霉素抗性基因，只有成功安装sgRNA并正确循环化的质粒才能使大肠杆菌在卡那霉素存在下生长。随后挑取克隆进行序列验证，确认sgRNA序列正确插入且质粒骨架完整。原文摘要未详述转化方法（热激或电转）及序列验证所用的测序引物位置。
酵母的LiAc/PEG共转化
验证正确的质粒与HDR供体共同转化入酵母。转化采用醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）方法：酵母细胞经醋酸锂处理增加通透性，PEG促进DNA附着于细胞膜，热激促进DNA摄取。方案未给出LiAc浓度、PEG分子量、热激温度与时间的具体数值，但明确了转化后需经过恢复培养。
筛选与验证流程
转化后的酵母涂布于YPD + G418平板上，30°C培养2–3天。G418筛选富集携带KanMX标记CRISPR质粒的酵母。预期结果中，“CRISPR + HDR供体”条件通常产生大量菌落，而“无修复（–HDR供体）”对照组菌落极少，因为Cas9切割在无修复模板时是致死的。这一“多对少”的对比是初步读出的关键指标，同时验证了转化与筛选体系的有效性以及所选sgRNA在目标位点的切割效率。
下游验证中，挑取6–8个菌落进行菌落PCR，所用引物位于同源臂外侧。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增子。缺失和插入突变应相对未编辑对照显示条带位移，点突变则可能需要DNA测序确认。成功的实验应至少有一部分筛选菌落对预期编辑呈PCR阳性，跨接合位点的DNA测序应确认设计的基因型，包括供体中包含的沉默PAM破坏突变。
最后，在非选择性培养基（YPD）中生长后，一部分编辑克隆应丢失KanMX标记的CRISPR质粒。这可以通过在YPD和YPD + G418平板上影印培养来评估——丢失质粒的克隆能在YPD上生长，但无法在G418上生长。
研究结果
转化效率与初步筛选的“多对少”判断
按照方案操作，在30°C培养2–3天后，“CRISPR + HDR供体”条件下的YPD + G418平板通常出现大量菌落，而“无修复（–HDR供体）”对照组仅有极少数菌落。这一对比源于Cas9切割的致死性——没有修复模板时，双链断裂无法修复，细胞死亡。该结果同时确认了三件事：转化成功、筛选有效、sgRNA在目标位点具备高效切割能力。原文未提供具体的菌落计数数据，但明确描述了“many vs few”的定性对比。
编辑克隆的PCR验证与条带位移
当用侧翼引物（位于同源臂外侧）对6–8个菌落进行菌落PCR时，正确编辑的克隆产生预期大小的扩增产物。对于缺失或插入类型的编辑，PCR产物相对未编辑对照呈现明显的条带位移——缺失导致条带变小，插入导致条带变大。点突变由于不改变扩增子大小，需要DNA测序进一步确认。原文摘要未给出具体的扩增子大小数值或PCR循环条件。
测序确认与PAM破坏突变的验证
跨编辑接合位点的DNA测序是最终确认手段。成功的实验中，至少一部分筛选菌落对预期编辑呈PCR阳性，测序结果确认设计的基因型，包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。原文未提供测序成功率的具体百分比数据。
质粒丢失与克隆“治愈”
在非选择性培养基（YPD）中传代培养后，一部分编辑克隆会自然丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过影印培养到YPD和YPD + G418平板上可以评估丢失情况：成功“治愈”的克隆在YPD上正常生长，但在YPD + G418上无法生长。这一特性允许研究者在不依赖额外工具的情况下清除编辑株中的CRISPR质粒，为后续表型分析或重复编辑扫清障碍。原文未给出质粒丢失率的具体数据，但指出“a fraction of edited clones”应丢失质粒。
讨论与展望
这套方案最直接的贡献是把sgRNA更换从“克隆操作”降维成“PCR操作”。对于需要同时测试多个向导RNA的实验室来说，节省的时间不是以小时计，而是以天计。PCR引导的插入方式也规避了酶切不完全、连接效率低等经典痛点，尤其适合高通量编辑场景。
一个值得注意的设计细节是质粒的无缝循环化——这一策略使得sgRNA安装后无需额外的线性化处理，简化了流程的同时也减少了操作失误的可能。另一个亮点是G418筛选与质粒丢失评估的结合：KanMX标记既是筛选工具，也充当了“可移除标签”的角色，让编辑株的后续应用更加灵活。
当然，方案中仍有若干参数未在摘要层面展开，例如PCR扩增的具体循环数、LiAc/PEG转化的精确条件（LiAc浓度、热激时间与温度）以及菌落PCR的退火温度等。这些细节的完整呈现需要查阅全文。对于已经熟悉酵母操作的实验室，这套方案可以直接替换现有的CRISPR编辑流程；对于新进入该领域的研究者，它提供了一个从设计到验证的完整路线图。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protoc. PMID: 42519825.
PMID: 42519825