来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
自然界中，异黄酮以其独特的C6-C3-C6骨架结构，构成了植物次生代谢产物中一个极具药理与生理价值的重要家族。长久以来，科学家对豆科植物中异黄酮的合成机制已有深入解析，但其他植物科属中这一代谢路径的分子基础却始终笼罩在迷雾之中。南京的研究团队近日在《自然·通讯》上发表成果，首次揭示了鸢尾科植物中一套完整的异黄酮生物合成途径——这条途径不仅与豆科截然不同，更可能代表了陆生植物中一种古老的原型路线。该发现填补了鸢尾科植物异黄酮生物合成认知的长期空白，也为理解不同植物科属间代谢机制的独立演化轨迹提供了全新视角。
研究背景
异黄酮是一类主要分布于植物界的次生代谢产物，其典型特征是由两个芳香环通过中央三碳桥连接而成的C6-C3-C6骨架。这类化合物在植物防御、信号传导以及根瘤共生等生理过程中扮演关键角色，同时在人类健康领域也展现出广泛的药理活性，如雌激素样作用、抗氧化及抗肿瘤特性。
过去数十年间，豆科植物——尤其是大豆——中的异黄酮合成路径已被研究得相当透彻。关键酶如CYP93C家族的异黄酮合酶（IFS）催化黄烷酮B环从C2位迁移至C3位，从而形成异黄酮的基本骨架。此外，禾本科植物中则依赖CYP71F家族执行类似功能。然而，除这两个科之外，其他植物类群如何合成异黄酮，分子层面的机制几乎是一片空白。
鸢尾科植物长期以来被报道能积累多种异黄酮类化合物，但催化这些反应的酶从未被鉴定。这种"知其然不知其所以然"的状态，构成了植物天然产物研究中的一个显著缺口。本研究正是瞄准这一空白，以鸢尾科代表植物——白花射干（B. chinensis）为材料，系统解析了其异黄酮合成的完整酶促级联。
研究方法
植物材料与基础试剂
研究团队从中国药科大学药用植物园（南京，31°53′N，118°54′E）采集了白花射干及其他鸢尾科植物材料。基因组DNA提取使用天根生化科技的植物基因组DNA试剂盒，总RNA分离则采用RNAsimple总RNA提取试剂盒。随后利用诺唯赞（Vazyme）的HiScript III第一链cDNA合成试剂盒构建了cDNA文库。所有用于提取和生化分析的溶剂均为HPLC/MS级纯度。酶促反应和微生物培养所需的化合物与抗生素分别购自陕西宝鸡的Herbest公司和Sigma-Aldrich（上海）。各类酶与分子生物学试剂盒来自诺唯赞、北京全式金生物和上海碧云天生物技术公司。
粗蛋白制备与酶活测定
研究团队分别从白花射干的根茎和根部提取粗蛋白。操作流程如下：组织在液氮中研磨成细粉，然后按5:1（体积/质量）的比例加入100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）进行匀浆。匀浆液在4°C条件下搅拌4小时，随后以3580 × g离心10分钟去除组织碎片。所得上清液进一步在4°C下以25,000 × g离心2小时。沉淀用冰浴的磷酸盐缓冲液重悬，供后续分析使用。蛋白浓度通过碧云天的BCA蛋白定量试剂盒测定。
酶活测定在200 μL反应体系中进行，包含测定缓冲液（50 mM磷酸钾、200 mM NaCl，pH 7.5）、50 μg粗蛋白、2 mM NADPH、1 mM DTT以及100 μM的不同底物（如柚皮素、芹菜素或染料木素）。反应在25°C条件下孵育12小时，随后通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）分析产物。原文摘要未详述反应终止的具体方式及产物萃取步骤。
候选基因筛选与异源表达
由于在鸢尾科植物的基因组和转录组数据中未检索到此前在豆科（CYP93C）和禾本科（CYP71F）中编码IFS的同源基因，研究团队将目光投向CYP71家族——所有已知IFS酶均属于CYP71支系。考虑到异黄酮类化合物主要积累在白花射干的根和根茎中，他们优先筛选在地下组织中高表达的CYP71家族成员。从这一候选集中初步圈定13个CYP71候选基因，其中11个成功克隆至真核表达载体。
体外功能验证显示，仅有一个候选基因（Bch12G003021）能够将柚皮素转化为染料木素。该活性进一步通过从大肠杆菌中纯化的重组Bch12G003021蛋白得到确认，产物身份由高分辨质谱（HR-MS）验证。底物谱分析表明，Bch12G003021还能接受橙皮素、甘草素和圣草酚作为底物，但对6-羟基化黄酮类化合物卡他明（carthamidin）无催化活性。这一底物偏好暗示鸢尾科植物采取了先形成异黄酮骨架、后进行羟基化的独特生物合成策略。反应过程中未检测到中间产物或副产物。
研究结果
关键酶鉴定：CYP736D家族异黄酮合酶
Bch12G003021编码的酶被鉴定为CYP736D家族的成员，这是一个此前从未与异黄酮合成关联过的细胞色素P450家族。该酶能够催化黄烷酮（如柚皮素）的B环从C2位迁移至C3位，形成异黄酮的核心骨架。值得注意的是，这一反应机制与豆科CYP93C家族IFS的功能相似，但酶分子本身却属于完全不同的进化分支。
对底物特异性的深入分析揭示了一个关键差异：Bch12G003021对6-羟基化黄酮卡他明无催化活性，这意味着鸢尾科植物中异黄酮的羟基化修饰发生在骨架形成之后，而非之前。这一顺序与豆科植物中某些羟基化先行的策略形成鲜明对比。原文摘要未提供该酶的动力学参数（如Km、kcat等具体数值）。
非CYP450的黄酮/异黄酮6-羟化酶
除IFS外，研究团队还鉴定了一个功能独特的酶——非CYP450类型的（异）黄酮6-羟化酶。该酶的催化功能此前在植物中未曾被表征。与依赖血红素铁的细胞色素P450氧化酶不同，这类羟化酶采用了不同的催化机制，具体细节原文摘要未详述。该酶的发现扩展了植物中芳香环羟基化反应的酶学工具箱——以往认为这类反应主要由P450酶主导。
两个阳离子依赖型I类O-甲基转移酶
路径中还包含两个阳离子依赖型的I类O-甲基转移酶（OMT）。这类酶通常依赖二价金属离子（如Mg²⁺）作为辅助因子，催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至底物的羟基基团上。在异黄酮修饰途径中，O-甲基化是生成甲氧基化异黄酮（如鸢尾素、芒柄花素等）的关键步骤。这两个OMT的具体底物特异性和甲基化位点，原文摘要未详述。
新鉴定的CYP75F异黄酮3'-羟化酶
路径的末端修饰涉及一个新鉴定的CYP75F家族酶，该酶催化异黄酮B环3'位的羟基化反应。CYP75F是细胞色素P450超家族中此前功能未知的一个分支，本研究首次赋予其明确的生化功能。3'-羟基化修饰在异黄酮的药理活性调控中具有重要意义，该酶的鉴定补齐了鸢尾科异黄酮结构多样化的最后一块拼图。
进化分析：古老而保守的原始途径
进化分析结果显示，鸢尾科植物保留了一条古老且高度保守的异黄酮生物合成途径。该系统发育位置表明，这条途径可能代表了陆生植物中异黄酮合成的原型路线。相比之下，大豆所采用的途径是豆科特有的、后期分化出的专门化路线。两条途径在进化上独立起源，却殊途同归地实现了异黄酮的合成——这是趋同进化在植物代谢领域的一个典型案例。
研究团队指出，这一发现不仅解决了鸢尾科植物异黄酮生物合成的长期疑问，更揭示了异黄酮合成机制在鸢尾科与豆科中各自独立演化的轨迹。从应用角度看，CYP736D等新酶的鉴定为异黄酮类药物的微生物异源合成提供了全新的酶学元件——原文摘要未提供具体的产量数据或发酵参数。
讨论与展望
鸢尾科异黄酮途径的完整解析，在植物次生代谢进化研究中有其独特价值。此前学界普遍将豆科的CYP93C-IFS视为异黄酮合酶的"标准答案"，而本研究揭示的CYP736D-IFS表明，自然界至少存在两套独立演化出的催化同一化学反应的酶系统。这种功能趋同而序列分化的现象，对基于同源搜索的基因功能注释策略提出了警示——序列相似性并非功能保守的充分条件。
该途径中非P450羟化酶的参与同样值得关注。在植物氧化修饰酶学中，P450一直占据主导地位，而这里发现的非P450类型6-羟化酶提示，某些被认为由P450垄断的反应，在特定植物类群中可能由其他酶家族执行。这扩展了合成生物学中可供选择的酶工具箱。
从应用维度看，CYP736D家族IFS的底物谱较宽（可接受柚皮素、橙皮素、甘草素、圣草酚），且反应过程中无副产物积累，这些特性对于异黄酮的微生物细胞工厂构建具有潜在吸引力。原文摘要未提供工程化应用的具体数据，但酶学特征的初步表征已显示出一定的工业应用前景。
未来值得关注的方向包括：鸢尾科其他物种中该途径的保守程度如何？非P450羟化酶的催化机制细节是什么？这些酶能否在异源宿主中实现功能重建？原文摘要未涉及上述问题，需要后续研究予以回答。
参考来源
Zhao Y, Shi X, Zhang X, Amy Lyu MJ, Tian M. Discovery of an isoflavone biosynthetic pathway in Iridaceae plants. Nature Communications. PMID: 42362562.
PMID: 42362562