来源：Front Plant Sci | 编译：DNA Lab Space
人参皂苷，尤其是稀有的Compound K（CK）和Rh2，药理活性强劲，却在天然人参中含量极低。提取难、含量微，限制了它们的开发应用。一项新研究给出了一条不同路径——把合成通路搬进烟草。武汉的研究团队将三种关键酶基因导入本氏烟草和栽培烟草K326，成功在根系中检测到CK最高47.87 μg/g干重、Rh2最高8.11 μg/g干重的积累量。更值得关注的是，由转基因叶片诱导的愈伤组织也能合成这两种皂苷，为体外生产提供了概念验证。烟草，这种田间常见的作物，或许能成为稀有皂苷的新来源。
研究背景
人参皂苷是五加科植物人参的主要活性成分。其中，稀有人参皂苷CK和Rh2因在抗肿瘤、抗炎、免疫调节等方面的显著活性而备受关注。然而，它们在天然人参中的含量极低——CK是人参皂苷在肠道内的代谢产物，原植物中几乎不存在；Rh2含量同样微乎其微。传统获取方式依赖人参提取或化学修饰，周期长、成本高、产率低。
合成生物学的兴起为这一问题提供了替代方案。通过解析人参皂苷的生物合成途径，研究者已鉴定出关键酶基因：达玛烯二醇合成酶（DDS）催化IPP/DMAPP环化生成达玛烯二醇，细胞色素P450酶CYP716A47在其C-12位引入羟基生成原人参二醇，随后由糖基转移酶（UGT）催化糖基化修饰，生成不同的皂苷产物。理论上，将这三步反应的关键基因导入异源宿主，即可重构稀有皂苷的合成通路。
烟草作为遗传转化模式植物，生物量大、生长周期短、转化体系成熟，是异源合成天然产物的理想底盘。但此前的研究多集中于本氏烟草瞬时表达，稳定遗传转化并系统比较不同烟草物种间合成效率的工作鲜有报道。本研究同时考察了本氏烟草（N. benthamiana）和栽培烟草K326（N. tabacum K326）两种底盘，并探索了打顶处理与愈伤组织培养对皂苷积累的影响。
研究方法
载体构建与基因合成。 研究选取了人参皂苷生物合成途径中的三个关键酶基因：达玛烯二醇合酶PgDDS（GenBank ID: GU183405.1）、细胞色素P450酶CYP716A47（GenBank ID: JN604536.1），以及两种糖基转移酶之一——UGTPg1（GenBank ID: KF377585.1，用于合成CK）或UGTPg45（GenBank ID: KM401918.1，用于合成Rh2）。所有基因由武汉Biorun有限公司合成。每个基因的表达框结构一致：5′端连接花椰菜花叶病毒35S启动子，3′端连接胭脂碱合酶（NOS）终止子。最终构建的载体包含三个串联排列的表达盒：35S–PgDDS–NOS、35S–CYP716A47–NOS和35S–UGT–NOS。
农杆菌介导的遗传转化。 采用冻融法将多基因过表达载体导入根癌农杆菌GV3101菌株。转化后的农杆菌在含25 mg/L潮霉素的5 mL YEB培养基中，28°C、200 rpm振荡培养至OD600≈0.8。菌液经4°C、5,000 rpm离心10分钟收集，用等体积含100 μM乙酰丁香酮的MS培养基重悬，调整OD600至0.3–0.5备用。
叶盘法转化烟草。 取4–6周龄无菌培养的本氏烟草和K326植株叶片，切成0.5–1 cm²的叶盘，置于含2.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上，25°C暗培养预培养2天。随后将叶盘浸入农杆菌菌液，轻轻振荡10分钟，用无菌滤纸吸干表面菌液，转移至含100 μM乙酰丁香酮的相同培养基上，20–22°C暗培养共培养2–3天。
共培养结束后，叶盘转移至除菌培养基（预培养培养基成分加500 mg/L头孢噻肟），25°C暗培养7天。原文摘要未详述后续筛选培养的具体光照条件和继代周期，但明确表示通过PCR和RT-PCR对转基因T2代株系进行了分子鉴定。RT-qPCR用于检测目的基因的表达水平，LC-MS方法经过完整方法学验证用于皂苷含量定量。
打顶处理与愈伤组织诱导。 对K326转基因株系进行打顶处理（去除顶端分生组织），考察其对皂苷积累的影响。此外，从转基因叶片诱导愈伤组织，探索体外培养生产皂苷的可行性。原文摘要未详述愈伤组织诱导的具体激素配比和培养条件。
研究结果
转基因株系的筛选与鉴定。 含UGTPg1基因的多基因过表达载体成功导入本氏烟草和K326（图1A）。对本氏烟草的140个转基因株系进行系统筛选后，共鉴定出6个阳性株系能够合成稀有皂苷CK，分别为N8-7、N14-1、N14-7、N14-8、N14-9和N14-10（图1B、1C）。K326中则筛选出9个阳性株系：P8-7、P8-8、P8-10、P9-8、P12-10、P13-3、P13-4、P13-5和P13-8（图1D、1E）。
CK在本氏烟草中的组织特异性积累。 代谢物定量分析显示，本氏烟草叶片中CK含量最高达到24.36 μg/g干重（DW），而根系中最高积累量达到47.87 μg/g DW。在所有阳性株系中，根中CK含量始终高于叶片，根叶比范围为1.53至2.59（图1F）。这一组织分布特征表明，根系可能是稀有皂苷合成或储存的主要场所。
Rh2在K326中的积累。 与CK在本氏烟草中高效积累不同，Rh2的合成在K326中表现更优。K326根系中Rh2积累量最高达8.11 μg/g DW。两种烟草物种中，根组织的皂苷含量均一致性地高于叶片。这一结果提示，不同烟草物种对不同皂苷产物的合成效率存在显著差异——本氏烟草更适合CK的积累，而K326在Rh2合成方面具有优势。
打顶处理对皂苷积累的影响。 对K326株系进行打顶处理后，CK和Rh2含量均有所增加。但作者特别指出，这一效应应谨慎解读，因为实验缺乏模拟创伤对照和时间过程对照。打顶本身造成的机械损伤可能诱发防御反应，进而影响次生代谢物的积累，因此尚不能将皂苷含量的增加明确归因于顶端分生组织的去除。
愈伤组织培养实现体外生产。 由转基因叶片诱导的愈伤组织成功合成了稀有皂苷——CK含量达20.52 μg/g DW，Rh2含量为0.98 μg/g DW。虽然产量低于整株植物的根系积累水平，但这一结果证明了不依赖完整植株的体外生产路径的可行性，为规模化培养提供了概念验证。
底盘物种选择的启示。 综合来看，本氏烟草在CK合成方面表现突出，K326则在Rh2积累上更胜一筹。两种物种的差异可能源于内源UDP-糖供体水平、P450酶活性或产物的转运储存能力不同。研究结果强调了物种特异性底盘选择在异源合成中的关键作用——不存在“万能宿主”，需要根据目标产物的化学结构选择最适配的植物底盘。
讨论与展望
这项研究把三种人参皂苷合成基因同时装进烟草基因组，用稳定遗传的T2代株系证明了异源生产的可行性。47.87 μg/g DW的CK积累量在植物底盘研究中处于可观水平，但距离商业化生产仍有距离。
一个值得注意的现象是皂苷在根中的优先积累。这或许与植物天然将防御性次生代谢物储存于地下器官的策略有关——但本研究的测定对象是干重含量，根组织含水量低、干物质密度高，也可能在数值上放大了这一差异。无论机制如何，这一发现对收获策略有直接指导意义：如果以皂苷为目标产物，根系而非叶片才是重点采收部位。
打顶实验的设计缺陷（缺乏模拟创伤对照）被作者坦率指出，这种自我审视在科研论文中并不多见。愈伤组织培养的尝试虽产量有限，却打开了不依赖土壤、不依赖季节的体外生产想象空间。
未来要推进这项工作，至少有三个方向值得投入：一是系统比较更多烟草物种或品种的合成效率，建立底盘筛选的量化标准；二是优化打顶实验设计，明确机械创伤与顶端去除的各自贡献；三是提升愈伤组织的规模化培养水平，探索生物反应器中的工业化生产。人参皂苷从田间到发酵罐，这条路正在被一步步走通。
参考来源
Cao L, Li X, Lang S, Chen Y, Dong P. Metabolic engineering of tobacco for heterologous production of rare ginsenosides CK and Rh2. Front Plant Sci. PMID: 42483519.
PMID: 42483519