来源：核酸凝胶弥散电压过高（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完胶一看，条带胖了一圈，marker都糊成一片，相邻两条带连在一起。第一反应往往是胶浓度配错了，或者上样量太大。其实十次里有六次是电压给高了。这篇按"低级错误—分模块系统排查—进阶疑难"三层走一遍，每一步都给判断标准、具体参数和验证动作，照着做，大多数弥散问题当场就能定位。
第一步：先花两分钟排掉低级错误
这几种错误新手常犯，改起来最快。
1. 缓冲液没没过凝胶。液面低于胶面2mm，局部就发热。补1×TAE到高出胶面2-3mm再跑。
2. 电源设置看错。以为设了100V，实际是200V；或者模式从恒压切成了恒功率。开跑前盯一眼显示屏上的V和mA。
3. 缓冲液反复用到第4、5次。离子耗光，同样电压下电阻升高、产热变多。新配1×TAE或0.5×TBE，每跑1-2次就换。
4. 上样量顶满孔。20μL的孔硬加25μL，条带横向摊开。每孔100-200ng DNA，上样体积不超过孔容积的80%。
第二步：按实验流程分模块系统排查
模块一：电泳参数与产热（电压这条主线）
1. 电压设定过高，或没按电极间距换算
现象：整块胶的条带都变宽，相邻带连成一片，溴酚蓝前沿发毛、不锐利。
原理：场强超过10 V/cm，焦耳热 Q=I²Rt 明显，胶温能冲到50°C以上。温度一高，DNA扩散系数往上走，琼脂糖孔径也不均匀，条带自然糊。电压给得越高，糊得越快。
解决：按电极间距算，目标5-8 V/cm。量一下两电极之间的距离，10cm就设50-80V。微型胶（7×10cm）常规100V跑30-40分钟已经接近上限，别动不动150V"快点跑完"。
验证：跑完用手背摸胶槽外壁，温热正常，烫手就是过热。看溴酚蓝前沿，应该是一条细线；散成一片说明电压或缓冲液有问题。
2. 恒压模式下缓冲液离子耗尽
现象：前10分钟还正常，20分钟后条带逐渐发虚，胶体发热。
原理：缓冲液重复使用，离子被电解消耗，电阻上升。恒压时电流一路往下掉，槽内场强不均匀，条带被"拉"开。
解决：微型槽缓冲液不少于500mL，覆盖胶面2-3mm。跑2次换新，别心疼那点TAE。
验证：开机看电流。1×TAE、1%胶、100V，微型槽正常在30-50mA。电流明显偏低，就是该换液了。
3. 散热差、室温太高
现象：夏天下午跑的胶特别容易糊，靠槽边的孔比中间的更严重。
原理：没有循环冷却，槽内形成温度梯度，边缘和中间迁移速度不一样，出现"微笑"条带。
解决：槽边放冰袋，或者直接搬进4°C冷房跑；也可以把电压降到80V，时间拉长到50-60分钟。
验证：跑胶中途摸槽壁，明显发烫就加冰或降温。
模块二：凝胶与上样
4. 琼脂糖浓度和片段大小不匹配
现象：小于300bp的小片段，用0.8%胶跑出来又宽又淡。
原理：凝胶孔径大于片段尺寸，DNA在里面自由扩散，根本筛不住。
解决：小于500bp用1.5%-2%胶，500bp-2kb用1%，大于2kb用0.7%-0.8%。胶厚控制在3-5mm，太厚散热更差。
验证：看marker相邻100bp的条带能不能分开，分不开就是浓度偏低。
5. 上样量过多或样本盐浓度高
现象：条带拖尾、孔底发亮、带型前倾。
原理：DNA量超出孔容量，迁移时互相挤压；洗脱液里盐浓度高，改变局部电导，条带被"推"着走。
解决：每孔100-200ng，基因组DNA 50-100ng足够。盐高的样本用TE稀释5倍，或者过一次纯化柱。
验证：上样量减半重跑一板，条带变锐就说明是超载。
6. 胶没凝透、点样孔破损
现象：孔底漏样，条带下缘毛糙。
原理：凝固不到30分钟就拔梳子，孔壁被撕出缺口。
解决：室温凝固30-40分钟，厚胶给到40分钟。拔梳子前把胶连托盘浸进1×TAE 2分钟，垂直往上拔。
验证：上样前对着灯看孔，孔壁完整、孔底平整再上样。
模块三：样本本身
7. 核酸降解
现象：主带下方一片弥散拖尾，甚至看不到主带。
原理：核酸酶污染，或者样本反复冻融。
解决：样本分装后-20°C保存，操作戴手套，用水用DEPC处理过的。
验证：上样前取1μL测浓度和A260/280，比值低于1.8就要警惕。
8. 电泳缓冲液pH偏碱
现象：条带整体偏移、发虚。
解决：1×TAE现配现用，EDTA补到1mM。用pH试纸测一下，落在7.8-8.2之间再用。
第三步：几个进阶疑难
大片段和质粒超螺旋。大于10kb的片段，电压稍高就糊成一片，超螺旋的两条带也分不开。把场强降到3-5 V/cm，4°C跑1-1.5小时，染色改成跑完后置染（GelRed 1×染30分钟），带型会锐很多。
边缘效应。中间跑得快、两边慢，是槽内温度不均或电极老化。换个槽、降电压、加缓冲液循环，三招里总有一招管用。
低浓度样本又弥散。上样量本来就少，盐还高，条带既淡又糊。先用TE稀释或过柱脱盐，再按100ng上样，别靠加大体积硬凑。
避坑总结
三条核心结论：
- 电压按V/cm算，5-8 V/cm是安全区，微型胶100V是上限，不是标配。
- 缓冲液每1-2次换新，覆盖胶面2-3mm，宁可多倒别省。
- 遇到弥散，先减半上样量、换新缓冲液重跑一板，七成