来源：qPCR标准曲线线性差模板抑制（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
标准曲线R²只有0.97，扩增效率78%，或者反过来飙到135%，复孔看着挺齐，一拉曲线就翘尾。这类问题最耗时间。别急着换引物，八成不是引物的锅。下面按“低级错误—模板抑制—稀释误差—体系干扰—板子仪器”的顺序走一遍，每个原因都给判断方法、解决动作和验证手段，覆盖模板抑制、移液误差、二聚体干扰三类主因。照着做，大多数曲线能在两小时内救回来。
第一步：快速排查低级错误
先花五分钟看这四条，很多人卡在这里。
1. 稀释不换枪头、不混匀：每级换滤芯枪头，涡旋5 s，瞬时离心再取下一级。
2. 用1 µL转移做10倍稀释：改成5 µL模板+45 µL水，或10 µL+90 µL，转移体积别低于5 µL。
3. 阈值让软件自动设：改成手动阈值，统一设在指数扩增期中段，所有板同一高度。
4. 稀释用普通离心管、冰上操作：换低吸附管，稀释液和模板先回温到室温再用。
第二步：分维度系统排查
模块一：模板里的抑制物（占一半以上）
现象：10倍梯度往下走，前两三个点Ct偏高甚至压不出峰，稀释到10⁻³之后Ct突然“跳”回正常，相邻两点ΔCt只有2.2而不是3.3。
原理：裂解液残留、柱纯化的乙醇和胍盐、SDS、EDTA、肝素、血红素、腐殖酸，会直接压Taq酶活性或螯合Mg²⁺。抑制物跟着模板一起被稀释，所以越稀越“正常”。
解决步骤：①取2 µL cDNA加18 µL水做1:10预稀释，再往下做梯度；②柱纯化样本洗柱后65 °C开盖干5 min，或补一次200 µL 75%乙醇空转1 min；③反应体系里加BSA到0.1 µg/µL