来源：克隆菌落PCR假阳性模板（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
菌落PCR条带亮得晃眼，一测序却是空载——这种假阳性，谁做克隆没踩过几回？挑菌、裂解、加样，看着都顺手，可条带就是会骗人。它骗你的方式还很多：卫星菌落、模板带太多、引物乱配对、质粒气溶胶飘进管子里。别急着怀疑连接效率。这篇按“低级错误→流程分模块→进阶疑难”的顺序，把克隆菌落PCR假阳性的常见来源和验证动作一次拆完。每步都给判断标准和具体参数，你照着做就能排。
第一步：快速排查低级错误
1. 挑菌挑太大，把培养基和甘油全带进PCR管。 牙签轻触菌落表面，挑直径0.5-1 mm的单菌落，在管壁蹭两下即可；别插进琼脂里，别蘸到甘油管。
2. 菌落没裂解就直接当模板。 10 μL无菌水或10 mM NaOH悬菌，95°C 10分钟，取1-2 μL上清进25 μL体系；整块菌落扔进去会抑制Taq。
3. 引物用了载体通用引物，空载也扩增。 一条载体引物加一条插入片段内部引物，空载就扩不出条带；或者两条