来源：CRISPR编辑效率低核糖核蛋白转运（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
RNP电转做了三四次，GFP对照亮，编辑率却卡在5%–10%。细胞死得不多，测序也没信号。问题通常不在“CRISPR不行”，而在核糖核蛋白转运链条上。下面按复合物组装、电转进入、细胞状态、检测窗口拆开讲，给你可直接照做的参数和判断路径。
第一步：先扫低级错误
- Cas9与sgRNA比例拍脑袋：按1:1混，sgRNA常常不够，改成20 pmol Cas9配24–40 pmol sgRNA，摩尔比1:1.2–1:2。
- 室温孵育太久：RNP孵育10–20 min足够，超过30 min在低盐缓冲里易聚集，现配现用，别在冰上放一下午。
- 电转缓冲液用错：PBS和培养基电阻不对，换供应商Nucleofector buffer或专用20 µL电转体系，细胞先用PBS洗两次再去血清。
- 细胞太满或太稀：每管1×10^5–2×10^5细胞，活率>90%，传代<20代，汇合度70%–80%时收集。
第二步：分维度系统排查
按实验流程拆成四段。别一次换三个变量。每轮只改一个条件，同批留GFP电转对照和已知有效sgRNA阳性对照。
1. RNP复合物没组装好
现象：重复孔编辑率5%–15%，阴性对照干净，GFP电转阳性率却>70%。
原理：Cas9与sgRNA摩尔比失衡时，游离sgRNA被核酸酶降解，Cas9空载进核也切不了靶点。
解决：冰上解冻10 µM Cas9，sgRNA用无核酸酶水稀释到10 µM；20 pmol Cas9加24–40 pmol sgRNA，补Nucleofector buffer到10 µL，室温孵育10–15 min。轻弹混匀，不涡旋。用低吸附管。
验证：取1 µL复合物加2×蛋白上样缓冲液，95°C 5 min，跑6% native PAGE或琼脂糖凝胶迁移，看游离sgRNA条带是否减少。更直接是设“Cas9-only”“sgRNA-only”对照，别只跑完整复合物。
2. 电转参数把RNP挡在胞外
现象：48 h细胞活率还有80%，编辑率<10%；或活率掉到30%，编辑率也低。
原理：电场强度不够，细胞膜通透不足；电场太强，细胞先死。RNP带负电，要靠合适脉冲进入胞质。
解决：1×10^5–2×10^5细胞，20 µL体系，20 pmol Cas9 RNP。HEK293T常用CM-130；原代T细胞先CD3/CD28激活48 h，再用EO-115。电转条避免气泡，电转后立即加500 µL预温培养基，37°C、5% CO2静置24 h不换液。
验证：同批电转GFP mRNA或2 µg GFP质粒，24 h流式看阳性率。低于50%先修转运，别急着怪sgRNA。
3. 细胞状态拖后腿
现象：同一套RNP，