来源：低拷贝质粒提取放线菌破壁酶解（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
低拷贝质粒提不出来，最让人上头：菌长得好好的，破壁也做了，最后电泳孔里空空如也。放线菌壁厚、次级代谢物多，低拷贝质粒更像“针尖里找糖”。这篇按接种、收菌、酶解、碱裂解、纯化、洗脱逐段排查，给你能直接照做的参数和判断动作。
第一步：快速排查低级错误
- 菌量根本不够：低拷贝质粒别拿 3 mL 过夜菌硬提，至少用 50 mL 培养物，链霉菌建议 28–30°C、180 rpm 培养 24–36 h，湿重收到 0.5–1 g 再往下做。解决：按湿重补足菌量，别只看 OD。
- 酶解缓冲液不对：把溶菌酶随便丢进 PBS 或 pH 6.0 缓冲液，酶活大概率掉一半。解决：用 pH 8.0 的 10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、20% 蔗糖重悬，现配现用。
- 菌体没重悬开就加碱：一团一团的菌块外面裂了、里面还是生的。解决：先用移液器吹散，再加溶菌酶 5 mg/mL，37°C 45–60 min，每 10 min 轻柔颠倒。
- 洗脱体积太小或 pH 不对：低拷贝还只洗 20 µL，得率当然难看。解决：用 60°C 预热的 EB 50 µL 洗一次，再补 30 µL 洗第二次，静置 2 min 再离心。
第二步：分维度系统排查
1. 接种与收菌：现象是菌体沉淀少、管壁发黏、上清浑浊。低拷贝质粒拷贝数低，后期再纯化也变不出量；放线菌还可能产大量次级代谢物和核酸酶。解决：接种量 1:100，用 TSB 或 YEME，28–30°C、180 rpm 培养到稳定早期；4°C、8000×g 离心 10 min 收菌，用 10 mM EDTA 洗涤一次。验证：称湿重，低于 0.3 g 就加培养体积。
2. 酶解破壁：现象是加碱后仍黏丝、溶液不澄清，电泳看不到质粒条带。放线菌肽聚糖交联厚，单一溶菌酶常不够。解决：每克湿菌用 5 mL 含 20% 蔗糖的溶液 I 重悬，加溶菌酶 5 mg/mL、mutanolysin 200 U/mL、无色肽酶 1 mg/mL，37°C 45–60 min；30 min 时补一次新鲜溶菌酶 2 mg/mL。验证：取 10 µL 镜检，菌体变圆或碎片化；黏度明显下降再进碱裂解。别急着加碱，破壁不彻底后面全是假象。
3. 碱裂解与中和：现象是基因组 DNA 拖尾、质粒产量低、沉淀抱团。碱裂解时间一长，低拷贝质粒也会被基因组污染拖死。解决：加现配的 0.2 M NaOH、1% SDS，室温静置不超过 5 min，颠倒 6–8 次，禁止涡旋；加 3 M KAc pH 5.5 中和，冰浴 10 min，4°C、12000×g 离心 10 min。验证：上清应清亮，若还有白色絮团，延长冰浴 5 min 再离心。
4. 去蛋白与浓缩：现象是 A260/280 低于 1.7、酶切失败。放线菌蛋白和多糖容易共沉淀。解决：上清加等体积酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，12000×g、4°C 离心 10 min；重复一次，再用氯仿抽提一次。加 0.1 倍体积 3 M NaAc pH 5.2、2.5 倍体积无水乙醇，-20°C 30 min；12000×g、4°C 离心 15 min，70% 乙醇洗一次，风干 5–10 min，溶入 30 µL TE。验证：Nanodrop 看 A260/280 在 1.8 左右，琼脂糖凝胶上质粒条带应清晰。
5. 柱纯化与洗脱：现象是柱子上样后洗脱空、得率低。低拷贝上样量别超过柱容量，否则质粒被基因组 DNA 挤掉。解决：上样前加 0.1 倍体积 3 M NaAc 和 2.5 倍无水乙醇，-20°C 10 min；分两管过柱，洗脱用 60°C EB 50 µL，静置 2 min，再 30 µL 二次洗脱。验证：取 5 µL 跑 0.8% 琼脂糖凝胶，配合 PCR 或单酶切确认质粒完整性。
第三步：进阶疑难问题
内源核酸酶降解：现象是质粒条带弥散、低于预期大小。放线菌后期培养物核酸酶活跃，破壁时间一长就切了。解决：