来源：无细胞表达体系蛋白沉淀分子拥挤剂（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完4小时的无细胞反应，离心一看，管底一层白絮。上清里目标蛋白少得可怜。分子拥挤剂本来是拿来把产量拉上去的，结果先把蛋白挤出来了。这篇把PEG、Ficoll、葡聚糖这几类拥挤剂引起的沉淀拆开讲：从加样时的低级错误，到浓度、分子量、盐离子、温度时间，再到下游纯化的干扰。照着做，你能分清沉淀到底是真聚集，还是假沉淀。
第一步：快速排查低级错误
别急着怀疑体系设计。先把这四个动作过一遍，大概率有一半问题出在这。
1. PEG母液没溶透：40%（w/v）PEG 8000母液必须加热到60°C搅拌至完全澄清再0.22 µm过滤，没溶透的母液加进去就是晶核，直接换新配的。
2. 终浓度算错：20 µL反应里加2 µL 40%母液，终浓度是4%（w/v），不是稀释倍数算出来的2%。加样前把公式写在管壁上。
3. 模板DNA加太多：质粒终浓度超过20 ng/µL时，PEG会把DNA一起挤沉，沉淀里一半是质粒，把模板降到5–10 ng/µL重做。
4. 管子吸附：普通离心管对低浓度蛋白有贴壁损失，换低吸附管，同时确认管子没有酒精残留。
第二步：分维度系统排查
沉淀问题按流程拆成三块看：拥挤剂本身、反应体系匹配、时间与温度。每块给出判断路径。
1. 拥挤剂浓度越过增益窗口
现象：沉淀量随PEG浓度几乎线性上升，反应液OD600肉眼可见变浑。
原理：PEG 8000在2–6%（w/v）提升有效浓度的效果最好，超过8%时排阻效应过强，折叠中间体还没被伴侣接住就成核了。
解决：做0/2/4/6/8%（w/v）五点梯度，20 µL体系，30°C、120 rpm孵育4 h，每组三复孔。
验证：上清与沉淀分别跑12% SDS-PAGE，可溶目标蛋白占总目标蛋白（上清+沉淀）比例超过70%的浓度才算可用窗口。
2. 分子量选错
现象：小蛋白（<30 kDa）一加PEG 8000就沉，换PEG 3350后好转。
原理：拥挤半径小，排阻体积小，对折叠中间体的挤压更温和。
解决：<30 kDa用PEG 3350或Ficoll-70，终浓度3–5%；>60 kDa再用PEG 8000 4–6%。
验证：同体系换拥挤剂重跑，比较上清中可溶蛋白量与比活。
3. 批次氧化降解物
现象：换了新一瓶PEG，之前正常的体系突然全沉。
原理：PEG储存中产生的过氧化物和醛类会交联蛋白、氧化游离巯基。
解决：新批次母液加1 mM DTT或0.1 mM EDTA预处理，或直接换低氧化规格。
验证：1 mg/mL BSA在相同拥挤剂里30°C孵育2 h，测OD600；也可以在母液里加DTNB看游离巯基反应性。
4. 盐与Mg²⁺有效浓度被抬高
现象：沉淀呈白色絮状，溶解后A260/A280比值明显偏高。
原理：PEG抢走水化层，Mg²⁺和谷氨酸根活度上升，核酸-蛋白共沉淀被放大。
解决：Mg(OAc)₂从12–16 mM降到8–10 mM，谷氨酸钾从100 mM降到60–80 mM。拥挤剂最后加，加之前把模板和盐混匀。
验证：沉淀用0.1% SDS溶解后测核酸蛋白比，比值>1.5说明核酸被带下来了，方向要改到降盐而不是改折叠。
5. 氧化还原环境不匹配
现象：含二硫键的蛋白几乎全在沉淀里，上清只剩杂带。
原理：拥挤剂抬高折叠中间体浓度，错误的二硫键一旦形成就被锁定。
解决：体系里换成1–2 mM GSH加0.2–0.4 mM GSSG，DTT降到0.2 mM以下，必要时补5 µM PDI。
验证：非还原SDS-PAGE（不加DTT和β-巯基乙醇）看条带迁移率是否漂移。
6. 翻译太快，折叠跟不上
现象：2 h取样上清还有蛋白，4 h后沉淀明显增多。
原理：拥挤剂提高翻译速率，但体系里伴侣系统的容量是固定的。
解决：温度从37°C降到25–30°C，反应缩到2–3 h；每小时补2 mM ATP和1 mM GTP分批供能。
验证：每小时取2 µL，12000 g离心5 min，上清跑胶，看可溶蛋白是否出现平台期。
7. 蛋白浓度顶到表观溶解度上限
现象：总产量越高沉淀越多，上清目标蛋白浓度卡在1.5–2 mg/mL不动。
原理：拥挤剂降低表观溶解度，产物自己把自己挤出来。
解决：放大反应体积而不是提高单位体积产量，或加0.1% Tween-20、0.5 M精氨酸助溶（精氨酸对部分体系有翻译抑制，先做5 µL小试）。
验证：上清A280定量，画产量-时间曲线，出现平台就是到顶了。
第三步：进阶疑难问题
假沉淀：拥挤剂相分离
PEG和葡聚糖混用时会自发形成两相体系，离心看到的"沉淀"其实是富聚合物相，不是蛋白。判断方法很简单：跑一个不加模板的空白反应，同样条件离心，管底也有东西就是相分离。换成单一拥挤剂即可。
下游纯化被PEG拖累
Ni-NTA结合效率下降、SEC峰形前移，都是残留PEG在作怪。上柱前稀释5倍，或用30 kDa超滤管换液3次、每次4 mL缓冲液，能把PEG降到干扰阈值以下。
膜蛋白和无结构蛋白方向相反
这两类蛋白加拥挤剂只会更糟。直接去掉拥挤剂，改用nanodisc或者补0.5% DDM、0.02% LMNG维持分散状态，别在拥挤剂浓度上死磕。
避坑总结与实操建议
三条核心结论：
- 拥挤剂是典型的"增益窗口"参数，2–6%（w/v）已经是多数无细胞体系的上限，超过就是纯亏。
- 见到沉淀先分别跑上清和沉淀，再谈原因。上来就换体系，只会把变量越搅越乱。
- 核酸共沉淀和真聚集的处理方向完全相反，先测A260/A280再动手。
两个日常好习惯：
- 每批新配的PEG母液做一次BSA浊度小试，30°C