来源：微滴乳液PCR油相蒸发液滴合并（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
微滴乳液PCR最怕两件事：油相悄悄少了，液滴悄悄并了。跑完40个循环，原本单分散的微滴变成大油团，阳性信号扎堆，定量直接失真。别急着怀疑引物。先把油相、水相、芯片/管壁、热循环密封和读取环节逐项排掉。下面按“先看低级错，再走流程，最后抠疑难”的顺序，把常见原因和验证动作一次讲清。
第一步：快速排查低级错误
1. 油相没加表面活性剂，或加错类型。 氟油体系直接看是否含1%–2%（w/w）PFPE-PEG类表面活性剂；没有就换新鲜配好的油相。
2. PCR板/芯片没封严，边缘孔油相蒸发。 用光学透明压敏膜封板，滚轮压300–500 g，再加30–50 µL矿物油覆盖边缘孔。
3. 水相:油相比例偏大，液滴挤在一起。 按水相:油相=1:4配，比如20 µL水相加80 µL油相；别做到1:1。
4. 混匀太猛或枪头剪切太强。 乳化后禁止涡旋，移液器慢吸慢放2–3次，用低吸附宽口枪头。
第二步：分维度系统排查
1. 油相配方与表面活性剂耗竭
现象： 热循环前液滴正常，10–15个循环后边缘开始并滴，油膜变薄。
原理： 氟油对PDMS和塑料壁有润湿倾向，表面活性剂被壁面吸附后，液滴界面膜强度下降。油相挥发后液滴间距缩小，合并概率直线上升。
解决： 用HFE-7500或FC-40作连续相，加1%–2%（w/w）PFPE-PEG表面活性剂，现配现用。芯片/孔板先用含1%表面活性剂的氟油预饱和10分钟，65°C烘1小时后再用。油相4°C避光保存，开封后7天内用完。
验证： 显微镜下数0循环和10循环的并滴率，控制在5%以内；油相称重，40个循环后失重<2%。
2. 水相盐浓度、蛋白和去垢剂超标
现象： 95°C变性5分钟后出现絮状沉淀，液滴界面发花。
原理： 高盐和高浓度蛋白在高温下改变界面张力，SDS、Triton X-100会直接破坏氟油-水界面膜。
解决： MgCl₂控制在2–4 mM，dNTP每种0.2–0.4 mM，引物0.2–0.5 µM。BSA加到0.05–0.1 mg/mL，别超过0.2 mg/mL。体系里不能有SDS；Tween-20若必须用，≤0.01%。裂解液样本先1:10稀释。
验证： 水相95°C孵育5分钟，室温放2分钟，看是否澄清；乳化后立即镜检，液滴50–100 µm、CV<10%再上机。
3. 乳化剪切和液滴尺寸失控
现象： 液滴大小不齐，大滴>150 µm，局部排得太密。
原理： 液滴越大人越少，油膜薄，热运动下更容易合并。剪切不足还会留下大油水团。
解决： 微流控芯片设水相100 µL/h、油相300–400 µL/h；批量乳化用油相4份加水相1份，2400 rpm涡旋30秒，立刻冰上静置1分钟。油相过0.22 µm滤膜，水相过0.45 µm滤膜。
验证： 取2 µL乳液到载玻片，40×镜检至少100个液滴，直径50–100 µm、CV<10%为合格。
4. 热循环密封和油相蒸发
现象： 板边缘孔油面下降，孔壁有油膜，液滴向边缘聚集。
原理： HFE类氟油蒸气压高，95°C下不封严就会跑油；油少了，液滴堆积、膜破裂。
解决： 用PCR级光学压敏膜封板，滚轮压实；边缘孔加30–50 µL矿物油。热盖设105°C，升温速率2°C/s，95°C保持30秒，别拉到98°C长时间。封板后300 g离心30秒赶气泡。
验证： 40个循环前后称板重，失重<2%；肉眼看不到边缘孔油面明显下降。
5. PDMS芯片吸附和孔壁润湿
现象： 液滴贴壁、出口处成串合并。
原理： PDMS疏水恢复不完整，氟油渗入后表面能变化，液滴在壁面铺展。
解决： PDMS芯片用含1% PFPE-PEG的HFE-7500灌注，室温静置10分钟，65°C烘1小时；或改用玻璃-硅芯片。进样前用氟油润洗通道2分钟。
验证： 接触角>100°；空油冲洗后通道内无挂滴，液滴通过出口不贴壁。
6. 转移、离心和保存造成机械合并
现象： 乳化后正常，转移一次并滴率翻倍。
原理： 乳液已处于紧密堆积状态，涡旋、快吸快放、高速离心都会让液滴碰撞。
解决： 乳化后不涡旋；移液速度控制在20 µL/s以内；离心用300 g、30秒，别用10000 g。4°C保存不超过24小时，禁止冻存