来源：单细胞转录组文库扩增偏倚线性化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你的scRNA-seq数据是不是老出现高表达基因把UMI吸干、低丰度转录本凭空消失、3'端覆盖堆成山？文库扩增偏倚和线性范围不足，是单细胞实验里最隐蔽的坑。产量看着挺高，测序一跑全是重复。本文按实验流程拆成10个排查点，从细胞悬液到测序饱和度，每个点给你现象、原理、解决和验证，直接照着做。
第一步：快速排查低级错误
1. 细胞悬液死细胞太多——活率低于70%时，游离RNA会抢占捕获微珠，台盼蓝计数看一眼，低了就用Dead Cell Removal Kit（如Miltenyi 130-090-101）过一遍再上机。
2. cDNA扩增循环数抄错——10x 3' v3.1标准是12个循环，你跑成14个，高丰度cDNA早饱和了，回到12循环重做，别犹豫。
3. AMPure XP比例记反——cDNA纯化用0.6×，你上了1.8×，小片段全丢、大片段偏倚拉满，核对比例再选。
4. 逆转录引物反复冻融——TSO引物冻融超过5次，效率掉一半，分装成10 μL小份，-80°C存，用一次扔一支。
第二步：分维度系统排查
按流程走，从细胞悬液到测序，逐个维度卡。
1. 细胞悬液与RNA完整性
现象：捕获细胞数正常，但median genes/cell只有800-1000，远低于同类型组织3000+的预期。原理：RNA降解后短片段优先逆转录，长转录本3'端丢失，扩增时又被短片段压制。解决：抽1×10^5细胞做Agilent 2100 RIN检测，RIN<7就别硬上；悬液制备全程4°C，裂解时间控制在5分钟内。验证：跑2个细胞的qPCR看GAPDH和ACTB的Cq值，差值>3说明降解。
2. 逆转录效率与模板切换
现象：UMI计数饱和度低，测序深度加到50k reads/cell时新增UMI仍不收敛。原理：RT酶在模板二级结构处停滞，或TSO模板切换效率低，部分转录本根本没被标记上。解决：换Maxima H Minus RT（42°C 90分钟，85°C 5分钟灭活），TSO引物加LNA修饰；逆转录前65°C变性5分钟，冰上2分钟。验证：用ERCC spike-in算逆转录效率，低于15%就重做。
3. cDNA预扩增循环数
现象：高表达基因（如RPL13A、MT-CO1）在UMI-rank曲线里早早平了，低丰度基因堆在底部起不来。原理：PCR循环数超过线性窗口，高丰度模板进平台期，低丰度模板还在指数期，比例失真。解决：10x 3' v3.1固定12循环，不要“多加2个循环提产量”；用KAPA HiFi HotStart（98°C 3分钟；98°C 15秒、67°C 20秒、72°C 30秒，12循环；72°C 5分钟）。验证：取2 μL扩增产物上Bioanalyzer，cDNA峰应在1000-6000 bp，产量30-80 ng/μL；超过100 ng/μL说明循环过了。
4. 纯化比例与片段筛选
现象：文库插入片段分布异常，短片段（<200 bp）占比超过20%，测序有效reads往下掉。原理：AMPure XP按比例截留，比例偏低小片段残留，偏高则大片段丢失，两头都会扭曲转录本长度分布。解决：