来源：CRISPR文库构建覆盖度低扩增循环数（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
建完CRISPR文库，测序回来覆盖度只有30%–50%，重复样本相关性还差，第一反应就是“循环数加两轮”。先别急。循环数只是表象，模板量、转化复杂度、PCR偏倚、纯化损失都会伪装成“循环数问题”。这篇按“先排低级错，再拆PCR、模板、纯化和QC”走一遍，参数直接给到你能照着设。
第一步：快速排查低级错误
- 引物拿错管或浓度标错：F/R引物用成旧批次，条带弱还非特异；直接核对管标签，10 µM工作液各加1 µL到50 µL体系，重新做无模板对照。
- 循环数照抄上一批：上批模板多、这批模板少，仍跑14轮，产量够但偏倚重；先做8/10/12/14轮预实验，选目标条带刚亮的那轮。
- 模板体积加错或没混匀：质粒池冻融后没涡旋，取到的是稀释层；模板稀释到5 ng/µL，涡旋5 s，加10–50 ng，Qubit dsDNA HS复测。
- 纯化前没做无模板对照：引物二聚体被当成文库测，覆盖度自然虚低；每批加NTC，2%琼脂糖看单一条带再上机。
第二步：分维度系统排查
1. 模板投入量不足，PCR在“抄瓶颈”
现象：产量正常，但低丰度sgRNA丢失，重复间重叠差。原理：PCR只扩增现有模板，60k sgRNA按100×覆盖需6×10⁶个质粒分子；1 ng 4 kb质粒约2×10⁷个分子，低于1 ng大概率进瓶颈。解决：Qubit dsDNA HS定量，模板稀释到5 ng/µL，50 µL体系加10–50 ng；设NTC。验证：qPCR Ct比NTC低8–12，电泳单一条带。
2. 循环数拍脑袋，少了重扩、多了偏倚
现象：12轮产量<500 ng，纯化后被迫再扩；18轮出现高分子量弥散，测序duplication升高。原理：PCR后期进入平台期，易扩增模板被放大