来源：细胞培养基支原体污染快检（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞养得好好的，快检却给你一记闷棍？qPCR阴性、培养法阳性，或者NTC先起峰。别急。支原体快检的坑，八成藏在取样、对照和判读里。这篇按“先查低级错、再按流程拆、最后啃疑难”走，覆盖qPCR、LAMP和培养法。每步给判断、验证和解决动作。你照着做，能把假阴性、假阳性和弱阳性分开。
第一步：快速排查低级错误
- 取样直接吸到底部细胞？轻晃T25瓶，取1 mL上清，300×g离心5分钟，别刮细胞沉淀。
- NTC忘了加，或者水和模板共用枪头？每板上机前先加NTC，水与模板分两区加，换枪头。
- qPCR mix反复冻融超过5次？分装成20 μL/管，-20°C避光存，用一管拿一管。
- 阳性对照和待检样本同区开盖？阳性对照最后加，开盖前离心10秒，超净台紫外30分钟。
第二步：分维度系统排查
1. 取样与前处理：同一瓶细胞Ct忽高忽低。
现象：今天Ct 34，明天Ct 38，复孔差2个循环以上。原理：支原体在培养上清和细胞表面分布不匀，取到细胞沉淀会带入DNA和抑制物。解决：轻晃T25瓶，取1 mL上清；300×g离心5分钟去细胞，取上清100 μL；12000×g离心10分钟浓缩，弃900 μL，留100 μL，95°C热裂解10分钟。验证：同瓶取3个点复测，Ct差小于1.5；内参Ct大于30就稀释5倍再上机。
2. 核酸提取与抑制物：曲线被压扁。
现象：样本管扩增曲线低平，内参Ct比NTC推迟2-3个循环。原理：培养基酚红、血清蛋白、细胞DNA会抑制Taq酶。解决：柱纯化按说明书做，最后洗脱30 μL；直接裂解法加BSA至0.1 mg/mL；血红素高时稀释10倍。验证：加10³ copies/μL外源对照，回收率应大于70%。回收率低，别硬判阴性。
3. qPCR体系与程序：阳性对照起峰晚、熔解曲线双峰。
现象：阳性对照Ct从28掉到33，熔解曲线出现双峰。原理：引物二聚体、Mg²⁺偏低、退火温度不匹配。解决：20 μL体系用10 μL 2×mix、0.4 μL 10 μM F/R、2 μL模板、7.2 μL水；程序95°C