来源：蛋白透析沉淀pH梯度调整（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做蛋白透析，最怕打开透析袋一看，里面全是絮状沉淀。你明明按文献换了缓冲液，pH也调了，蛋白就是不给面子。其实90%的透析沉淀都跟pH和离子强度的梯度设置有关。这篇教程按「透析前-透析中-透析后」三步走，把pH梯度调整的坑一个个填平，顺带给你能直接抄的参数。
第一步：快速排查低级错误
别急着上梯度。先看这几个新手常犯的错。
1. 透析袋没预处理。干袋直接装蛋白，残留硫化物和重金属会让蛋白在袋内壁变性。解决：2% NaHCO3 + 1 mM EDTA煮沸10分钟，超纯水再煮10分钟，4°C泡着备用。
2. 蛋白浓度太高。超过5 mg/mL时，pH稍微靠近pI就聚沉。解决：透析前用含100 mM NaCl的缓冲液稀释到1-2 mg/mL。
3. 透析液体积不够。蛋白透析需要至少100倍体积的缓冲液，否则小分子残留。解决：每2小时换一次液，换3次，最后一次过夜。
4. 搅拌子撞袋。磁力搅拌太快，透析袋被搅棒反复撞击，局部蛋白变性。解决：转速降到60-80 rpm，袋子别贴底。
第二步：分维度系统排查
如果低级错误都排除了，蛋白还是沉。按下面模块逐个查。
模块一：透析前——蛋白本身和起始缓冲液
1. 起始缓冲液和透析液pH差太多
现象：透析刚1小时，袋内出现大量絮状沉淀。原理：pH快速跨过蛋白等电点（pI），净电荷归零，水化层最薄，分子间静电排斥消失。解决：分步透析。比如从pH 6.0到pH 8.0，中间加pH 6.5、7.0、7.5三档，每档平衡2小时。验证：用pH计测透析袋