来源：大肠杆菌包涵体复性缓冲液筛选（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你辛辛苦苦把大肠杆菌诱导表达，超声破碎后一看，目标蛋白全在沉淀里。好不容易用8M尿素溶了，一透析又全析出。复性缓冲液换了七八种，活性还是零。别急着换载体。本文按“低级错误→缓冲液配方→进阶疑难”三步走，给你能直接抄的缓冲液配方和排查动作。
第一步：快速排查低级错误
先看四个新手常踩的坑。每一项一句话，直接改。
1. 包涵体洗涤不彻底。细胞碎片和膜蛋白混在里面，复性时先沉淀。解决：用50mM Tris pH 8.0 + 2M尿素 + 1% Triton X-100洗两次，每次4°C离心12000g 15分钟。
2. 溶解不彻底就急着复性。8M尿素没调pH，蛋白没完全打开。解决：50mM Tris pH 8.0 + 8M尿素 + 10mM DTT，室温搅拌1小时，12000g离心30分钟取上清。
3. 复性起始蛋白浓度太高。超过1 mg/mL，分子间碰撞概率大，直接聚沉。解决：Bradford定量，用复性缓冲液稀释到0.1-0.5 mg/mL。
4. 复性缓冲液没预冷。室温下疏水作用强，蛋白边复性边沉淀。解决：所有缓冲液4°C预冷，慢速搅拌，别用磁力搅拌器打旋。
第二步：分维度系统排查
按流程走：溶解残留→基础配方→添加剂→操作参数。每个原因给你