来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
纤维素酶的原位生产是提升二代乙醇工艺效率与可持续性的关键策略。本研究以甘蔗渣与麦麸（7:3 w/w）为底物，在多层填充床生物反应器中系统评估了嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila I-1D3b）在批式与连续两种操作模式下的内切葡聚糖酶生产、提取、回收与稳定化全流程。连续操作在保持平均酶活（96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹）的同时显著降低了模块间差异；硫酸铵沉淀回收率达78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹。热管理方面，最高温度不超过48.9 °C，证明该集成平台具备工业化应用潜力。
研究背景
循环生物经济理念推动下，木质纤维素生物精炼成为有机副产物高值化利用的重要平台。二代乙醇的经济可行性高度依赖高效纤维素酶的可获得性。原位产酶策略可减少对外购商品酶制剂的依赖，增强生物精炼厂的酶自给能力。
固态发酵（SSF）因能直接利用农业工业副产物为底物、较液体发酵耗水更低，契合循环生物经济原则而备受关注。在各类SSF反应器构型中，填充床系统因设计简洁、放大潜力大而具有吸引力。然而，传热受限、反应器操作复杂、下游处理困难等问题仍制约着SSF产酶的大规模实施。本研究针对上述瓶颈，以甘蔗渣和麦麸为底物，在多层填充床反应器中系统考察批式与连续操作模式下内切葡聚糖酶的生产、提取、回收与稳定化全链条，探索过程集成的可行性。
研究方法
微生物与底物
产酶菌株为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b，最初分离自巴西Usina Guarani（Olímpia, SP, Brazil）的甘蔗渣堆，前期摇瓶及反应器实验已证实其高产纤维素酶性能。
孢子制备：菌株接种于含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的斜面试管（Erlenmeyer瓶），在生化需氧量培养箱（BOD，Model SL 200, Solab, Brazil）中于45 °C培养至少48 h，促进菌丝生长和产孢。培养结束后，用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面孢子。该营养液pH调至5.0，组成（w/v）为：0.35%（NH₄）₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化为每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固态底物选用甘蔗渣（SCB）和麦麸（WB），二者成本低、区域供应充足，且能为固体基质提供有利的营养与结构条件。SCB由Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.（Brazil）提供，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro, São Carlos, SP, Brazil）。SCB先在鼓风干燥箱（Model 035, Marconi, Brazil）中于60 °C干燥至含水量10–15%（水分分析仪M5 Thermo, Bel Engineering, Monza, Italy测定），随后分别过5 × 5 mm和4 × 2 mm筛。麦麸按原样使用，含水量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床反应器固态发酵
SSF实验在文献[10]所述填充床反应器（PBB）中进行（图1）。系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，用于控制床层温度并缓解填充床SSF中常见的过热现象。
工艺空气由压缩机供给，依次通过针阀、生物过滤器、AppliTech®流量计（Asa, Italy），进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间空隙填充蒸馏水并保持在操作温度，使空气在进入反应器前达到饱和——该策略旨在减少SSF过程中床层的过度干燥。反应器出口处，渗透气体通过除湿系统：冷凝收集器连接接收瓶，随后进入直径5.2 cm、高39 cm的硅胶柱。该装置将出口空气相对湿度降至15%以下，满足Vaisala Carbocap探头（Vantaa, Finland）准确测量CO₂浓度的要求。
与Oliveira等[11]所述系统类似，反应器垂直放置，包含入口模块（IL）和出口模块（OL），两者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部为锥形几何结构。操作时空气自下而上流过固定床。位于系统底部的入口模块填充玻璃珠以促进气流均匀分布，出口模块留空以利于气体流动。另设两个辅助模块，分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）和干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块的过度失水并吸收出口模块壁面冷凝水分。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持在45 °C——该温度已被报道为 M. thermophila 产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验期间，工艺空气和循环水均通过模块及加湿器夹套中的水循环保持在45 °C，由恒温水浴（model SL-152, Solar, Brazil）供给；渗透空气流量固定为250 L h⁻¹，以增强氧传质并维持整个床层适当的水分条件。
发酵温度曲线通过安装在每个发酵模块进出口法兰上的T型热电偶实时监测。传感器尖端位于各模块径向中心（图1c），可全程监测床层内部温度演变。信号由National Instruments COMPAQ-DAQ数据采集系统记录，运行基于LabVIEW软件（National Instruments, Austin, USA）开发的自编程序。
模块添加、移除和重新定位过程中，固体底物会短暂暴露于实验室环境。所有操作均在无菌条件下进行以尽量减少微生物污染。底物与营养液分别在121 °C高压灭菌20 min。冷却后在经紫外辐射灭菌的超净工作台中将各组分与孢子悬浮液混合均匀。空气过滤器和加湿装置在每次发酵前同样灭菌。
发酵培养基由SCB与WB按7:3（w/w）比例混合配制。含水量调至75%（湿基），通过添加营养液和接种物悬浮液实现每克干固体1 × 10⁷个孢子的接种量。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为考察操作模式（批式与连续）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，连续操作又分为上行和下行两种模式（图2）。批式培养中，PBB在发酵开始时即装配所有发酵模块，并保持相同构型直至96 h终点。该条件作为与连续模式实验比较的参照。4天发酵使用4个发酵模块，编号L1、L2、L3、L4。
连续模式下，模块每24 h逐个添加，经历接种、装填、耦合至PBB的序列步骤。初始阶段床高逐步增加，直至最先插入的模块达到规定停留时间。此后进入稳态操作，特征为发酵成熟模块的移出与新接种模块的添加同步进行。模块运动方向取决于操作策略：上行（底部进料、顶部出料）或下行（顶部进料、底部出料）。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控是填充床反应器操作的主要技术挑战之一，代谢热积累可能损害酶稳定性和发酵过程的均一性。本研究考察了批式和连续操作模式对 M. thermophila I-1D3b 在木质纤维素底物（SCB:WB，7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3展示了批式操作（图3a）、上行连续操作（图3b）和下行连续操作（图3c）下四个发酵模块的温度时间演变。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度保持在45 °C附近，监测点间差异小于4 °C。批式操作下，初期温度升高，随后出现热峰并趋于稳定或略有下降——这与固定床系统中代谢热瞬时积累的行为一致。轴向热梯度的形成与单向通气内在相关，表现为温度沿反应器长度的分散。尽管过热程度较轻，梯度的持续存在可能影响床层内氧传质和蒸发速率。
连续操作（图3b、c）下，热曲线比批式模式波动更频繁，反映了发酵模块在整个过程中的间歇移动。尽管存在波动，温度仍保持在与批式操作相似范围内，未观察到明显的热过热现象。在96至210 h之间，每24 h添加和移除一个模块，系统沿柱体连续推进模块，行为接近活塞流反应器。该解释与Mitchell等[25]的结论一致——连续PBB操作可促进床层内过程条件的更大均匀性。
各操作模式下的最高温度和平均温度相近：峰值分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上行连续）、47.8 ± 0.8 °C（下行连续）；平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4和44.5 ± 0.5 °C，差异均无统计学意义（p > 0.05）。结果表明，在评价条件下两种操作模式均使系统保持在所需温度范围附近，无严重过热。
温度维持在接近最适范围，提示高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及模块移动策略的组合有利于代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等[26]报道的含甘蔗渣和麦麸系统的数值——后者在孔隙率0.55时观察到约3 °C的温升。相比之下，Ghildyal等[27]报道 Aspergillus niger 在麦麸PBB中培养时温度升高达15 °C。这些对比印证了床层物理结构在固态发酵热消散和热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置也影响反应器热曲线。图3c显示了新接种模块从反应器上部加入时连续发酵的热行为。该构型下热峰集中在PBB上部区域，与图3b中峰值出现在床层下部和中间区域的曲线形成对比。该差异表明新接种模块的位置直接影响系统内热量的空间分布。
图3c中每24 h记录的温度下降反映了模块添加、移除和移动的时刻，体现了连续操作间歇性特征。由于新模块从发酵区上部插入，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间的温度变化较小。该行为说明模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，应在系统操作设计中予以考虑。然而，受与下游系统集成的操作限制，本研究后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与水分
批式和上行连续操作下发酵模块的内切葡聚糖酶活性和最终含水量如图4a、b及表1所示。这些变量的控制对PBB性能至关重要——水热梯度低于10%时酶生产率可能降低30–50%[28]。
批式和连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相近，分别为95.63 ± 28.37和96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相似，连续过程中观察到的较低离散度表明各发酵模块间酶活的空间均一性更好。因此，两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性，而非平均产酶水平。
连续操作下的这种均一性与批式模式下更大的离散度形成对比——后者可归因于静态系统特有的水分、温度和氧可利用性的局部异质性。从操作角度看，连续模式代表更高的过程稳健性和可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间推移均暴露于热梯度和水分梯度的所有区域。根据Mitchell等[25]的观点，连续操作下PBB趋向于活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相和热条件。
这些结果与Rodrigues等[10]的报道一致——他们同样观察到 M. thermophila I-1D3b 在SCB:WB 7:3底物的PBB连续发酵中内切葡聚糖酶活性的更高均一性。
除酶活外，床层水分也是系统的关键方面，因为含水量降低直接损害SSF中真菌生长和代谢活性[28]。固体基质最终含水量（湿基%）见表1。
表1 M. thermophila 固态发酵后PBB入口和出口辅助模块及发酵模块的最终含水量（原文未完整呈现表格数据）
CO₂浓度曲线
图5展示了批式模式（图5a）和连续模式（图5b）下PBB出口气流中CO₂浓度的重复曲线。
连续操作下的酶回收
图6显示了连续操作下（SCB:WB 7:3 w/w）各模块获得的内切葡聚糖酶活性和回收率，提取流量分别为180 L h⁻¹（图6a）和2400 L h⁻¹（图6b）。
顺序渗透提取循环中的酶回收
图7展示了 Myceliophthora thermophila I-1D3b 发酵底物（甘蔗渣:麦麸，7:3 w/w）每次顺序渗透提取循环回收的内切葡聚糖酶活性。柱状图表示均值±标准差（n = 3），不同字母表示Tukey检验差异显著（p < 0.05）。
下游浓缩
图8显示了内切葡聚糖酶活性与（a）硫酸铵饱和度、（b）乙醇浓度的关系，以及（c）60%和70%饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学。
讨论与解读
本研究证实，M. thermophila I-1D3b 在甘蔗渣与麦麸底物上的固态发酵产内切葡聚糖酶，在多层填充床反应器中无论批式还是连续操作均技术可行且可重复。连续操作降低了床层内异质性，促进了各发酵模块间酶活性的更大均匀性，同时未牺牲相对于批式操作的平均产量水平。热曲线保持在物种最适范围附近——最高温度批式48.2 °C、连续48.9 °C——表明连续操作未损害系统稳定性。在评价的浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优异，从粗提液中回收总酶活单位的78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在测试条件下导致显著的酶活损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，在60 °C下孵育24 h后仍保留约92%的活性。综合来看，热控制、渗透提取和下游处理的集成对于二代乙醇链中原位生产纤维素酶平台的稳健性和适用性至关重要。
编译者解读
本研究最值得关注的亮点在于将"生产—提取—浓缩"整合于同一平台，且连续操作在保持产量不变的同时显著改善了空间均一性——这对工业放大意义重大，因为批次间波动往往是固态发酵产业化的痛点。硫酸铵沉淀78.7%的回收率和沉淀物60 °C下24 h保留92%活性的热稳定性数据，为酶制剂的低成本稳定化提供了直接参考。不过，连续操作中模块间歇移动带来的操作复杂度、以及提取流量从180增至2400 L h⁻¹时能耗代价与回收增益之间的权衡，原文未做经济性核算，后续放大验证时需补足这一维度。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. Bioprocess Biosyst Eng. PMID: 42370983.
PMID: 42370983