来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
一株以甲醇为唯一碳源的工程化毕赤酵母，通过平衡三条生物合成模块，将尿黑酸产量提升66倍，并进一步氧化聚合生成黑素。5升发酵罐204小时高密度发酵后，工程菌株Pyo29达到70.5 g/L的最高产量。这项研究为黑素的低成本工业化生产提供了一条可行路径。
黑素（pyomelanin）是一种天然的深棕色色素，在防晒、生物材料、环境修复等领域应用广泛。但天然产黑素微生物的产量极低，难以满足工业需求。微生物合成生物学改造被视为可持续且经济可行的替代方案。来自江南大学的研究团队以甲基营养型酵母Komagataella phaffii（即毕赤酵母）为底盘，系统性地重构了尿黑酸（homogentisic acid, HGA）合成途径，并通过颜色筛选系统辅助酶定向进化，最终实现了黑素的高效生物合成。相关成果发表于Nature Communications。
研究背景
黑素属于黑色素家族的一员，由尿黑酸经氧化聚合形成。尿黑酸是酪氨酸降解途径的中间代谢物，在天然微生物中合成量有限。传统提取法依赖自然资源，成本高且产量不稳定。合成生物学手段通过异源表达关键酶、增强前体供应、优化代谢通量，有望实现黑素的规模化生产。
毕赤酵母是工业上广泛使用的蛋白表达宿主，能以甲醇为唯一碳源生长，遗传操作体系成熟。本研究选择毕赤酵母作为底盘，正是看中了其高密度发酵的工业适配性。但毕赤酵母内源的尿黑酸合成途径催化效率较低——野生型菌株摇瓶发酵5天，尿黑酸产量仅25 mg/L，上清液几乎无色，OD400仅为0.006。即使外源添加不同浓度的L-酪氨酸，产量也无明显提升。这说明内源的羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）和酪氨酸转氨酶（TYRB）催化效率不足，成为合成途径的瓶颈。
研究方法
菌株与质粒构建
研究以毕赤酵母GS115（Invitrogen）为宿主菌。大肠杆菌TOP10F'用于质粒构建与扩增，BL21(DE3)用于蛋白表达。基因整合使用pZACH质粒，该质粒注重遗传稳定性；每次整合通过Cre/loxP ZeoR标记回收系统确保基因组整合的稳定性。基因敲除使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达与纯化使用pET-28a质粒。
异源酪氨酸转氨酶（TYRB）和羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）基因经密码子优化后由Generay公司合成。HPPD基因来自粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis），TYRB基因来自解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。
培养基与培养条件
大肠杆菌在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37°C培养。重组酵母在YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）或BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）中培养。
尿黑酸合成途径的构建
先将野生型菌株的尿黑酸产量作为基线。随后筛选不同来源的HPPD和TYRB基因。多拷贝整合是提高关键酶表达量的有效策略。研究将粪产碱杆菌来源的HPPD（AfHPPD）以多拷贝形式整合到基因组不同位点——HIS4、INT1和INT18。整合三个拷贝的菌株Pyo9尿黑酸产量最高。
颜色筛选系统与酶工程
尿黑酸在空气中自发氧化聚合会呈现棕色。研究利用这一特性建立了黑素颜色筛选系统——通过观察菌落或上清液的颜色深浅，快速判断尿黑酸产量高低。该系统用于对3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHPS）进行定向进化，以及对羟苯基丙酮酸双加氧酶进行半理性设计改造。原文摘要未详述突变体文库构建的具体参数和筛选通量。
黑素合成与发酵放大
尿黑酸经氧化聚合生成黑素。研究比较了两种聚合方式：碱性条件下的氧化聚合与漆酶（laccase）处理下的聚合。放大实验在5升发酵罐中进行高密度发酵，总时长204小时。原文摘要未详述发酵过程中的具体控制参数，如pH设定、溶氧水平、甲醇流加策略等。
研究结果
野生型菌株的尿黑酸合成能力
野生型毕赤酵母摇瓶发酵5天，尿黑酸产量为25 ± 0.85 mg/L。上清液无可见颜色变化，OD400仅为0.006。添加L-酪氨酸未能显著提升产量，说明内源酶的催化效率是主要限制因素。
异源酶表达的效果
表达粪产碱杆菌来源的HPPD和解脂耶氏酵母来源的TYRB均能显著提升尿黑酸产量。其中HPPD过表达的效果优于TYRB，这与文献报道中HPPD是尿黑酸合成途径关键酶的观点一致。
多拷贝整合的增益
菌株Pyo9携带三个AfHPPD拷贝，分别整合于HIS4、INT1和INT18位点，尿黑酸产量达到64.1 ± 0.68 mg/L，是野生型菌株的2.5倍。值得注意的是，Pyo9菌株的上清液呈现更深的浅棕色，OD400达到0.362，这归因于尿黑酸的自发氧化聚合。
模块平衡与产量跃升
通过平衡三条不同的生物合成模块——前体供应模块、尿黑酸合成模块和聚合模块，研究团队将尿黑酸产量提升了66倍。原文摘要未详述三条模块的具体划分和各自的代谢物通量数据。
颜色筛选系统与酶进化
黑素颜色筛选系统成功应用于DAHPS的定向进化和HPPD的半理性设计改造。原文摘要未提供突变体的具体酶动力学参数和催化效率提升倍数。
黑素聚合方式的差异
研究报道了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理下聚合所得黑素的差异。原文摘要未详述两种黑素在结构、分子量分布或光谱特性上的具体区别。
高密度发酵
在5升发酵罐中进行204小时高密度发酵后，工程菌株Pyo29达到最高产量70.5 ± 0.7 g/L。这是原文摘要中唯一明确给出的最终产量数据。
应用价值验证
研究最后展示了黑素的潜在应用价值。原文摘要未详述具体应用场景和性能测试数据。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于展示了甲醇到高值色素的完整生物合成链条。以甲醇为碳源的优势在于成本低廉且不与粮食竞争，契合绿色生物制造的导向。66倍的尿黑酸产量提升并非来自单一酶的改变，而是多种策略的叠加——异源酶筛选、多拷贝整合、模块平衡、酶工程改造，每一步都在前一步的基础上累加增益。
颜色筛选系统的设计颇为巧妙。尿黑酸自发聚合产生棕色这一“副反应”被转化为高通量筛选的表型指标，省去了繁琐的色谱检测步骤。这种“变废为宝”的思路在代谢工程中有推广价值。
5升罐204小时发酵获得70.5 g/L的产量，在天然色素生物合成领域属于较高水平。但原文摘要未提供发酵过程中的碳源转化率、产物得率等关键指标，这些参数对评估工业化经济性至关重要。此外，碱性聚合与漆酶聚合所得黑素的结构差异，将直接影响产品在具体应用场景中的性能表现，值得进一步探究。
黑素作为一种多功能天然色素，其生物合成路线的打通为工业化生产奠定了基础。下一步的挑战在于如何从实验室规模放大到生产规模，并优化下游提取工艺——原文摘要未提及提取纯化步骤的细节，这同样是产业化中不可回避的环节。
参考来源
Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nature Communications. PMID: 41839868.
PMID: 41839868