来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
第二代生物乙醇的产业化进程长期受制于纤维素酶成本高昂这一瓶颈。巴西研究人员以甘蔗渣与麦麸为底物，在多层填充床生物反应器中实现了嗜热真菌Myceliophthora thermophila I-1D3b的内切葡聚糖酶连续化生产，并将浸出提取与硫酸铵沉淀浓缩环节整合入同一技术链条。批式与连续两种操作模式的平均酶活相近，但连续模式的空间均一性显著更优，酶回收率达78.7%。
研究背景
循环生物经济倡导将有机副产物转化为能源、生物材料和高附加值生物产品。木质纤维素生物精炼厂作为关键平台，整合了生物技术与物理化学转化路线。第二代生物乙醇的可行性高度依赖高效的纤维素酶系——目前商品酶制剂的高成本严重制约了产业化进程。
原位产酶策略由此成为降低对外部酶制剂依赖的重要路径。固态发酵（SSF）凭借可直接利用农业工业副产物、水耗远低于液态发酵等优势，契合循环生物经济原则。在各类固态发酵反应器中，填充床系统因设计简洁而备受关注，但传热效率低、床层过热、下游处理困难等问题仍制约其放大应用。本研究以甘蔗渣与麦麸为底物，系统评估了多层填充床生物反应器在批式和连续操作模式下，生产、提取、回收及稳定化内切葡聚糖酶的全链条集成方案。
研究方法
微生物与底物
产酶菌株为嗜热真菌Myceliophthora thermophila I-1D3b，最初分离自巴西Usina Guarani（Olímpia, SP）的甘蔗渣堆，前期摇瓶及反应器规模实验已证实其高产纤维素酶性能。
菌种活化采用斜面琼脂培养：在含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的锥形瓶中接种，置于生化需氧量培养箱（BOD，型号SL 200，Solab，巴西）中，45 °C培养至少48 h以完成菌丝生长和产孢。培养结束后，用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面孢子。该营养液pH调至5.0，组成如下（w/v）：0.35% (NH₄)₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂和0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化至每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固态底物选用甘蔗渣（SCB）和麦麸（WB），二者成本低、区域供应充足，且能为固体基质提供有利的营养与结构条件。SCB由巴西Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.供应，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro，São Carlos，SP，巴西）。SCB先在鼓风干燥箱（型号035，Marconi，巴西）中60 °C干燥至水分含量10–15%，水分含量用水分分析仪（M5 Thermo，Bel Engineering，Monza，意大利）测定。干燥后过筛，筛孔尺寸为5 × 5 mm和4 × 2 mm。麦麸直接使用，水分含量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床生物反应器固态发酵
固态发酵实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间用作水夹套，实现床层温度控制，缓解填充床固态发酵中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供应，依次通过针阀、生物过滤器和AppliTech®流量计（Asa，意大利），随后进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间隙充满维持在操作温度的蒸馏水，以在空气进入反应器前促进其饱和——这一策略旨在最大程度减少固态发酵过程中的床层过度干燥。反应器出口处，渗滤气体通过除湿系统：冷凝物收集器连接接收瓶，随后经硅胶柱（直径5.2 cm，高39 cm）。该装置将出口空气相对湿度降至15%以下，这是使用Vaisala Carbocap探头（Vantaa，芬兰）准确测量CO₂浓度的必要条件。
反应器垂直放置，包括入口模块（IL）和出口模块（OL），二者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部几何结构为锥形。运行期间空气自下而上流过固定床。位于系统底部的入口模块填充玻璃珠以促进空气均匀分布，出口模块留空以利于气体流动。另有两个辅助模块分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）和干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块的过度失水并吸收出口模块壁面冷凝水分。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持45 °C——该温度已被报道为M. thermophila生产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验期间，过程空气和循环水均通过模块及加湿器夹套中的水循环保持在45 °C，由恒温水浴（型号SL-152，Solar，巴西）供应，渗滤空气流量固定为250 L h⁻¹，以增强氧气传质并维持整个床层适宜的水分条件。
发酵温度曲线使用T型热电偶随时间监测，热电偶通过法兰安装在每个发酵模块的入口和出口处。传感器尖端位于各模块径向中心，可监测整个发酵过程中床层内部温度的演变。信号由National Instruments COMPAQ-DAQ数据采集系统记录，运行基于LabVIEW软件（National Instruments，Austin，USA）开发的控制程序。
模块添加、移除和重新定位期间，固体底物会短暂暴露于实验室环境。但所有操作均在无菌条件下进行以尽量减少微生物污染。底物和营养液在高压灭菌器中121 °C灭菌20 min，冷却后在经紫外辐射灭菌的层流柜中与孢子悬浮液混合均匀。空气过滤器和加湿装置在每次发酵前也进行灭菌。
发酵培养基由SCB与WB按7:3（w/w）比例混合配制。水分含量通过添加营养液和接种物悬浮液调整至75%（湿基），接种量足以提供每克干固体1 × 10⁷个孢子。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为评估操作模式（批式和连续式）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，连续操作分上行和下行两种方向。
批式培养中，PBB在发酵开始时装配全部发酵模块，并保持相同构型直至96 h终点。该条件作为与连续模式实验比较的参考。4天发酵使用4个发酵模块，标记为L1、L2、L3和L4。
连续模式下，模块每24 h依次添加，经过接种、装填和耦合步骤接入PBB。初始阶段床层高度逐渐增加，直至首个插入模块达到指定停留时间。此后进入稳态操作，特征为发酵完成模块的撤出与新接种模块的添加同步进行。模块移动方向取决于操作策略：上行（底部进料、顶部撤出）或下行（顶部进料、底部撤出）。
酶活测定与下游处理
发酵结束后，各模块取出固体基质进行酶活分析。内切葡聚糖酶活性测定参照标准方法，以羧甲基纤维素钠为底物，DNS法测定还原糖生成量。酶活单位定义为每分钟生成1 μmol还原糖所需的酶量为1 U，结果以每克干底物的酶活单位（U·g.d.s⁻¹）表示。
酶提取采用渗滤方式：以一定流量的水通过发酵固体床层，收集渗滤液作为粗酶液。粗酶液进一步通过硫酸铵沉淀和乙醇沉淀两种策略进行浓缩。硫酸铵沉淀在20 °C下进行，饱和度梯度设置60%和70%两个水平；乙醇沉淀在4 °C下进行，终浓度设置为60%和70%（v/v）。沉淀物经离心收集后复溶于缓冲液，测定酶活和蛋白含量。
酶学性质表征包括最适pH和最适温度测定：在pH 3.0–7.0范围内和40–70 °C温度梯度下分别测定酶活。热稳定性实验在60 °C下孵育24 h，定期取样测定残余酶活。
统计分析
所有实验均设三次重复，数据以平均值±标准差表示。批式与连续模式间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验，显著性水平设定为p < 0.05。
研究结果
固态发酵过程中的热行为
热调控是填充床生物反应器运行的主要技术挑战之一，代谢热积累可能损害酶稳定性和发酵过程的均一性。本研究考察了批式和连续操作模式对M. thermophila I-1D3b在木质纤维素底物（SCB:WB，7:3 w/w）上生产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度接近45 °C，监测点间差异小于4 °C。批式操作下，初始温度升高，随后出现热峰，之后趋于稳定或略有下降——这与固定床系统中代谢热瞬态积累的行为一致。轴向温度梯度的形成与单向通气内在相关，表现为温度沿反应器长度的离散分布。尽管过热程度较轻，但梯度的持续存在可能影响床层内的氧气传质和蒸发速率。
连续操作下，热剖面比批式模式表现出更频繁的振荡，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在这些波动，温度仍保持在批式操作观察到的相似范围内，没有相关热过热的证据。在96至210 h之间，每24 h添加和移除一个模块，系统沿柱体连续推进模块，行为接近活塞流反应器。这与Mitchell等人的观点一致，即连续PBB操作可促进床层沿程过程条件的更大均匀性。
各操作模式的最大温度和平均温度相近：峰值温度分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上行连续）和47.8 ± 0.8 °C（下行连续），平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4和44.5 ± 0.5 °C，差异无统计学意义（p > 0.05）。结果表明，在评价条件下，两种操作模式均使系统保持在所需温度范围附近，无严重过热。
温度维持在接近最适范围的这一结果提示，高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及模块移动策略的组合有利于代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等人报道的含甘蔗渣和麦麸系统的0.55——后者观察到了约3 °C的温升。相比之下，Ghildyal等人在PBB中用黑曲霉培养于麦麸时报道了15 °C的温升。这些比较共同证实，床层物理结构在固态发酵的散热和温度梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置也影响反应器热剖面。图3c显示新鲜接种模块从反应器上部加入时的连续发酵热行为——温度峰值集中在PBB上部区域，与图3b中峰值出现在床层下部和中间区域的剖面形成对比。这一差异表明新接种模块所处位置直接影响系统内热量的空间分布。
图3c中每24 h记录到的温度下降反映了模块添加、移除和移动的时刻，表征了连续操作间歇性特征。由于新模块插入发酵区上部，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间推移热变化较小。这一行为表明模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，应在系统操作设计中予以考虑。然而，受与下游系统集成相关的操作限制，本研究后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与水分含量
在批式和上行连续操作下评估了内切葡聚糖酶活性和发酵模块的最终水分含量。这些变量的控制对PBB性能至关重要——水热梯度低于10%即可能使酶生产率降低30–50%。批式和连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相近，分别为95.63 ± 28.37和96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管平均值相似，但连续过程中观察到的较低离散度表明发酵模块间酶活的空间均一性更高。因此，两种操作模式的主要差异与过程的空间均匀性相关，而非平均酶产量水平。
连续操作下的这种均一性与批式模式下观察到的较大离散度形成对比——后者可归因于静态系统特有的水分、温度和氧气可利用性的局部异质性。从操作角度看，更高的均一性意味着更强的过程鲁棒性和可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间推移暴露于热梯度和水分梯度的所有区域。根据Mitchell等人的观点，连续操作下PBB趋向于活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相和热条件。
这些结果与Rodrigues等人此前报道一致，他们也观察到M. thermophila I-1D3b在PBB中以SCB:WB 7:3（w/w）底物连续发酵时内切葡聚糖酶活性具有更高均一性。
除酶活外，床层水分也是系统关键方面——固态发酵中水分含量下降直接损害真菌生长和代谢活性。固体基质最终水分含量（湿基%）见表1。
CO₂浓度监测
批式和连续模式下PBB出口气流中的CO₂浓度剖面如图5所示。CO₂浓度作为微生物代谢活动的间接指标，反映了发酵过程中底物消耗和产物生成的动态变化。批式模式下，CO₂浓度呈现先升后降的趋势，与微生物生长曲线相符；连续模式下，CO₂浓度波动更为频繁，与模块的周期性添加和撤出相对应。
连续模式下的酶回收
连续操作模式下，考察了不同渗滤提取流速对内切葡聚糖酶回收的影响。提取流速分别为180 L h⁻¹和2400 L h⁻¹。下标"E"表示通过渗滤回收的酶活，无下标数值表示对渗滤后固体进行补充提取得到的残余酶活。提高渗滤水流速显著增强了酶回收效率，表明传质是下游处理性能的关键限制因素。
逐次渗滤提取循环的酶回收
对M. thermophila I-1D3b发酵底物（甘蔗渣:麦麸，7:3 w/w）进行逐次渗滤提取循环，每次循环回收的内切葡聚糖酶活性如图所示。柱状图表示平均值±标准差（n = 3），不同字母表示Tukey检验差异显著（p < 0.05）。逐次提取循环的酶回收量呈现递减趋势，表明大部分可回收酶活在前几次提取循环中即被回收。
酶浓缩与稳定化
考察了硫酸铵饱和度和乙醇浓度对内切葡聚糖酶沉淀效果的影响，以及60%和70%饱和度硫酸铵沉淀的动力学曲线。硫酸铵沉淀性能优于乙醇：从粗酶液中回收总酶活单位的78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在评价条件下导致显著的酶活损失。
酶学性质表征
粗酶液在不同pH和温度条件下的酶活测定显示，最大酶活在60 °C和pH 4.0条件下获得，确认了该酶具有适合工业应用的嗜热嗜酸特性。沉淀后的提取物表现出高热稳定性，在60 °C孵育24 h后保留约92%的酶活。
讨论与解读
本研究证实，M. thermophila I-1D3b以甘蔗渣和麦麸为底物，在多层填充床生物反应器中以批式和连续两种模式进行固态发酵生产内切葡聚糖酶，在技术和重复性上均可行。连续操作降低了床层内异质性，促进了发酵模块间酶活的更大均匀性，同时未牺牲相对于批式操作的平均产量水平。温度剖面保持在物种最适范围附近，最高温度分别为48.2 °C（批式）和48.9 °C（连续），表明连续操作未损害系统稳定性。在评价的浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优越，回收率达78.7%，酶活156 U·g.d.s⁻¹，而乙醇在测试条件下导致净酶活损失。沉淀提取物具有高热稳定性，60 °C孵育24 h后保留约92%酶活。综上，热控制、渗滤提取和下游处理的集成对于该平台在第二代乙醇链中原位生产纤维素酶的鲁棒性和适用性至关重要。未来研究应在中试规模验证这些条件，并探索互补的纯化策略。
编译者解读
该研究的核心价值在于将"生产—提取—浓缩"三个环节整合于同一技术框架，直接回应了固态发酵酶制剂产业化的两大痛点：反应器放大中的传热传质不均，以及下游回收效率低下。连续操作显著缩小了模块间酶活差异（标准差从±28.37降至±4.63 U·g.d.s⁻¹），这一数据对工业过程的批次一致性控制具有直接参考意义。渗滤流速对酶回收的显著影响提示，传质优化可能是进一步提升整体收率的突破口。硫酸铵沉淀78.7%的回收率在粗酶液直接浓缩场景中表现良好，但乙醇沉淀的酶活损失也提醒我们，沉淀剂选择需结合具体酶蛋白特性。一个值得注意的局限是，研究未涉及酶液在真实水解场景中的糖化效率验证——酶活数据与水解性能之间仍存在鸿沟。后续若能在中试规模验证集成平台的经济可行性，将有力推动固态发酵酶制剂从实验室走向产业应用。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. Bioprocess Biosyst Eng. PMID: 42370983.
PMID: 42370983