来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理产生的低pH、高温及发酵抑制物等严苛条件对微生物宿主提出了极高要求。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现模式酵母酿酒酵母来源的表面展示组件在该酵母中失效后，基于其内源 IoSED1 基因构建了新型展示盒，成功实现增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的细胞表面功能展示。BGL展示菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在木质纤维素发酵抑制物存在下仍保持生长能力。这是首次在 I. orientalis 细胞表面成功固定功能蛋白并实现胁迫条件下木质纤维素衍生中间产物的同化利用。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了对非化石基可持续生产体系的需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因资源丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，前两者经化学和酶处理可水解为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等可发酵单糖，再经代谢工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母因抗噬菌体感染、遗传操作便利及异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化中颇具潜力的宿主。然而，大多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白的锚定结构域将纤维素酶展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的酸性热化学预处理会形成低pH、高温及含发酵抑制物的严苛培养条件，因此展示纤维素酶的宿主菌株必须具备对这些胁迫的显著耐受性。本研究选用具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母 I. orientalis，尝试在该酵母中建立细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
Escherichia coli NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）作为重组DNA操作宿主。E. coli 转化子在Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，培养温度37 °C。本研究所用 I. orientalis 野生型菌株共11株，均购自日本NITE生物资源中心（NBRC，东京）；所用 S. cerevisiae 野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母生长培养基为酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto-蛋白胨［Difco Laboratories，美国密歇根州］、20 g/L葡萄糖）、缺失尿嘧啶的合成完全（SC-URA）培养基（6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源碱［Difco Laboratories］、1.92 g/L不含尿嘧啶的酵母合成 dropout 补充物［Sigma-Aldrich，美国密苏里州］、20 g/L葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源碱［Difco Laboratories］、20 g/L葡萄糖）。
I. orientalis NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将 I. orientalis 和 S. cerevisiae 细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl和0.5 M KOH调节至2或6。使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，东京）在L形管中于30 °C或45 °C、40 rpm培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香兰素）的耐受性，细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600为1、0.1、0.01或0.001），各取3 µL点样于添加了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，使用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，东京）记录菌落生长。
I. orientalis NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，大阪）提取 I. orientalis NBRC1664基因组DNA。I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂分别以URA3-UP-F/URA3-UP-R引物和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增（Xiao et al. 2014）。这些片段通过重叠延伸PCR融合，所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在添加1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。IoURA3 ORF的缺失通过菌落PCR以Colony-P-F和Colony-P-R引物确认。为验证尿嘧啶营养缺陷型，转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线，于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，滋贺）按制造商说明书构建。本研究所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
IoURA3基因DNA片段以URA3-F和Colony-P-R引物从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA经PCR扩增，导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到pVT。用于增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示的基因表达盒（来自质粒pleGFP-SSS，Inokuma et al. 2020）以ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物PCR扩增，导入pVT的SacI位点，得到质粒pVT-SceGFP。
IoSED1编码区（除分泌信号外，表S4）以IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA PCR扩增。该片段与以Vector-F和Vector-R引物、以质粒plBG-SSS（Inokuma et al. 2016）为模板PCR产生的DNA片段融合。所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定结构域被替换为IoSED1锚定结构域。用于以IoSED1启动子、分泌信号和锚定结构域展示eGFP的质粒构建如下：含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段以IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物从 I. orientalis NBRC10737基因组DNA PCR扩增；eGFP编码区DNA片段以eGFP-F和eGFP-R引物从pleGFP-SSS PCR扩增；编码IoSED1锚定结构域的DNA片段以IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物从plBG-SSIoS PCR扩增。这三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
能够将基因导入 I. orientalis NBRC1664染色体2上先前鉴定的基因间位点IS2（Lee et al. 2022）的整合型质粒构建如下：IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段分别以IS2-UP-F/IS2-UP-R引物和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R引物从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增。在IS2-UP-R的重叠区域插入PacI识别位点。这两个DNA片段通过重叠延伸PCR融合，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。pVT-IoeGFP中用于展示eGFP的基因表达盒以IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物PCR扩增，所得片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：IoSED1启动子和分泌信号及IoSED1锚定结构域的DNA片段分别以IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2引物和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2引物从pVT-IoeGFP扩增。编码 A. aculeatus BGL1的DNA片段以BGL-F和BGL-R引物从plBG-SSS PCR扩增。这三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的 I. orientalis 菌株，将携带eGFP展示盒的游离型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT以相同方式导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。对于eGFP展示盒的基因组整合，整合型质粒pVT-IS-IoeGFP以PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的 I. orientalis 菌株，整合型质粒pVT-IS-IoBGL以PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoBG-int菌株。
所有 I. orientalis 菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照先前报道（Xiao et al. 2014）并作少量修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养，取适量接种至3 mL新鲜YPD培养基中继续培养至适当浓度后收集细胞，加入醋酸锂、单链载体DNA和待转化DNA，经热激处理后涂布于相应选择平板。
BGL活性测定
BGL活性测定使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物。将培养后的细胞悬液离心分离培养上清和细胞组分。细胞组分以磷酸缓冲液洗涤后重悬。向各组分中加入pNPG底物溶液（终浓度2 mM，溶于50 mM柠檬酸缓冲液，pH 5.0），于30 °C或45 °C反应10 min，加入0.2 M Na₂CO₃终止反应，测定405 nm处吸光度。一个酶活单位（U）定义为每分钟释放1 µmol对硝基苯酚所需的酶量。
纤维二糖发酵实验
将BGL展示菌株16-IoBG-int及其亲本菌株在YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，收集细胞并以SC培养基洗涤后，以初始OD600为0.05接种至含1.9%纤维二糖和0.1 M MOPS（pH 6.5）的SC培养基中。在添加25.4 mM 5-HMF或100 mM醋酸的相同培养基中进行胁迫条件下的生长实验。培养在30 °C、200 rpm条件下进行，定期取样测定OD600和残留纤维二糖浓度。纤维二糖浓度使用高效液相色谱（HPLC）系统测定。
研究结果
I. orientalis NBRC1664多胁迫耐受性的评估
为比较 I. orientalis 与模式酵母 S. cerevisiae 的多胁迫耐受性，本研究评估了从NBRC获得的11株 I. orientalis 中耐受性最强的NBRC1664菌株（图S1）与 S. cerevisiae BY4741在低pH、高温和木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，两个物种在pH 6时均生长良好，但 I. orientalis 的生长优于 S. cerevisiae。I. orientalis 在pH 2时表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同，而 S. cerevisiae 在pH 2时完全无法生长。类似地，在45 °C条件下 I. orientalis 成功生长而 S. cerevisiae 不能生长；两个菌株在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香兰素）存在下的生长情况，进行了点样实验（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的浓度范围内（Mills et al. 2009）。在添加适当营养物的SD培养基上，两个物种在非胁迫条件下均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis 在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而 S. cerevisiae 在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上结果表明，I. orientalis NBRC1664具有卓越的多胁迫耐受性。
展示eGFP的 I. orientalis 菌株的评估
为确定与GPI锚定结构域融合的蛋白质能否固定在 I. orientalis 细胞表面，本研究构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达先前已证明可在 S. cerevisiae 细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma et al. 2020），该表达盒由 S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定结构域以及 S. cerevisiae SAG1终止子组成（图2a）。携带该表达盒的游离型质粒pVT-SceGFP导入 I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株——其尿嘧啶营养缺陷型已通过生长分析确认（图S2）——并按照“材料与方法”部分所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
随后假设荧光缺失源于异源遗传元件在该 I. orientalis 菌株中功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定结构域对展示效率有决定性影响（Inokuma et al. 2014, 2016；Zhang et al. 2013）。因此，构建了修饰型展示盒，将这些元件分别替换为IoSED1基因的相应元件（图2a）。IoSED1基因与ScSED1基因同源（Kitagawa et al. 2010），根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber et al. 2004）推测编码GPI锚定蛋白。此外，源自IoSED1基因的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa et al. 2010）。将这一新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察到清晰的表面定位荧光（图2b）。该荧光模式与展示eGFP的 S. cerevisiae 菌株中观察到的模式相当（Inokuma et al. 2020），表明eGFP已成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
虽然检测到表面定位的eGFP信号，但仅在少数细胞中观察到荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，将展示盒整合至基因组。按“材料与方法”所述构建了设计用于将展示盒插入 I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee et al. 2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，呈现清晰表面定位信号的细胞比例显著增大（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综合来看，这些结果证明成功构建了能够在 I. orientalis 细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的 I. orientalis 菌株的评估
接下来，利用所构建的蛋白质细胞表面展示基因表达盒，构建了展示 A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao et al. 1988）的 I. orientalis 菌株，命名为16-IoBG-int（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h后，在30 °C下分别评估细胞组分和培养上清中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1在LCB生物转化预期高温条件下的活性（Yanase et al. 2010），将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著增加至30 °C条件下测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与 A. aculeatus BGL1的最适温度位于50 °C以上的高温范围这一事实一致（Murao et al. 1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵实验
为评估所构建的BGL展示菌株是否能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长，将16-IoBG-int菌株接种至含1.9%纤维二糖和0.1 M MOPS（pH 6.5）的SC培养基中于30 °C培养。如图4a所示，16-IoBG-int菌株在纤维二糖培养基中表现出稳健生长，而亲本菌株NBRC1664/ura3Δ几乎无法生长。培养过程中残留纤维二糖浓度的测定显示，16-IoBG-int菌株培养液中的纤维二糖随培养时间逐渐消耗，而亲本菌株培养液中的纤维二糖浓度基本保持不变（图4b）。
进一步在添加25.4 mM 5-HMF或100 mM醋酸的纤维二糖培养基中评估该菌株在胁迫条件下的生长表现。结果显示，在含5-HMF的培养基中（图4c），16-IoBG-int菌株仍能生长，但生长速率较无胁迫条件有所降低；在含100 mM醋酸的培养基中（图4d），16-IoBG-int菌株同样维持了生长能力。亲本菌株在所有条件下均无法在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中有效生长。这些结果表明，BGL展示菌株即使在木质纤维素发酵抑制物存在下仍能同化纤维二糖。
讨论与解读
本研究开发了一种适用于多胁迫耐受酵母 I. orientalis 的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的 I. orientalis 菌株非常适合高效的LCB生物转化。
本研究采用源自IoSED1基因的启动子、分泌信号和锚定结构域构建了新型基因表达盒，并成功展示了eGFP。发现与游离型质粒表达系统相比，展示盒的基因组整合显著提高了细胞表面呈现eGFP荧光的细胞比例，表明质粒型表达在 I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。这一解释得到先前报道的支持——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的游离型质粒在另一株 I. orientalis 菌株中也表现出不稳定性（Tran et al. 2019；Cao et al. 2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍观察到部分无荧光细胞。值得注意的是，如图2b所示，尺寸较小的细胞几乎不显示荧光，这可能与细胞周期阶段或细胞壁结构差异有关，原文未详述。
编译者解读
本研究的技术路径具有明确的合成生物学应用导向：选择非模式酵母 I. orientalis 作为底盘，解决的是木质纤维素生物转化中"菌株耐受性"与"酶展示功能"难以兼得的瓶颈问题。方法上的关键决策——以宿主内源SED1同源基因替换酿酒酵母来源的启动子、分泌信号和锚定结构域——体现了"底盘适配"这一合成生物学核心思维。基因组整合策略有效规避了游离型质粒在该酵母中的不稳定性，为后续引入更多纤维素酶基因提供了可靠平台。值得注意的是，BGL在45 °C下活性达30 °C时的3倍以上，与LCB预处理后高温同步糖化发酵场景高度契合。该系统的局限在于目前仅展示了单一纤维素酶，距离完整的纤维素降解酶系（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）协同展示仍有距离；多酶共展示与酶配比优化将是该平台走向实际应用的关键下一步。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235