来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷骨架的高价值活性天然产物，但在栽培人参中并不天然存在。本研究通过染色体水平基因组组装、比较基因组学与生化分析，鉴定出东北刺人参（Oplopanax elatus）中特化的达玛烷二烯醇合酶OeOSC14，揭示其由祖先多功能三萜合酶经复制和新功能化演化而来。作者进一步证明C12羟化酶功能缺失阻断了RK型人参皂苷下游氧化步骤，并在本氏烟草中重构完整通路，实现人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为核心、经糖基修饰形成的重要特殊代谢物，已报道超过20,000种结构。它们不仅具有抵御病虫害、塑造根际微生物组和影响作物品质的生态功能，还表现出免疫调节、抗炎和抗癌相关等药理活性。人参属植物富含以达玛烷为骨架、在C-3和C-6位发生不同糖基化修饰的人参皂苷。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其特征是达玛烷侧链脱水形成C-20/21或C-20/22双键，疏水性较母体化合物增强。与新鲜人参组织中占主导的普通人参皂苷不同，RK型人参皂苷在栽培人参中几乎不存在，通常需通过热或酸处理（如红参加工中的蒸制）获得。东北刺人参作为人参的近缘植物，可积累达玛烷二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，却不产生RK型人参皂苷，这一特性使其成为研究该类化合物生物合成与进化的理想材料。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用的一株健康东北刺人参个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。该种群种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘以保持根系完整，快速清洗后立即用液氮冷冻，随后保存于−80 °C备用。各组织类型的外观如图1B所示。采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为生成PacBio HiFi长读长数据，取总量15 µg高分子量DNA，使用gTUBE剪切，随后采用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统进行大小选择，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi共有序列在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程构建Hi-C文库，并在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量控制
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读段结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤以获得高质量清洁读段（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读段使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定到染色体上，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）对Hi-C数据进行过滤、排序和定向。最后，使用Juicebox v.1.11.08对组装结果进行人工校正，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，最终获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性通过BUSCO v.6.0.0评估。
转座元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，本研究采用了从头预测和同源比对相结合的策略。首先，使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后应用RepeatMasker结合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask对照Repbase数据库注释已知重复元件。此外，利用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq数据的转录组预测。同源预测方面，使用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）将近缘物种的蛋白序列比对到组装基因组上，随后使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果和对应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组中的重复区域，再基于同源预测方法得到的基因结构训练HMM模型，随后使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，先使用HISAT2 v.2.2.1将RNA-seq数据比对到基因组，再用StringTie v.2.2.0将比对读段组装为转录本，使用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并进一步优化转录本模型。最后，使用MAKER2整合三种方法预测的基因模型，生成高质量基因集。功能注释方面，使用BLASTP（E值<1e-10）将预测基因的蛋白序列与SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库比对，基于最佳BLASTP命中结果分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涵盖东北刺人参及18种其他植物：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类基因家族。为推断系统发育关系，基于鉴定的单拷贝基因家族提取相位1或四倍简并（4D）位点，使用RAxML v.8.2.12以GTRGAMMA模型构建最大似然（ML）系统发育树，1000次自举重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的四倍简并位点进一步用于使用PAML v4.9j包中的MCMCTree程序估算物种分化时间。分化时间在贝叶斯框架下采用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree使用参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库（https://timetree.org/home）获得的分化时间。基因家族扩张和收缩使用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，首先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，然后使用PAML中的codeml在F3X4模型下计算每个共线性区块内基因对间的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排名选择最佳命中基因对，并使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT），使用HMMER v.3.1b2在东北刺人参中进行基因家族预测，E值阈值<0.01。预测的蛋白序列进一步使用SeqKit v.2.6.1软件按长度过滤：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员使用在线工具Conserved Domain Database（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT等基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列与东北刺人参预测家族成员进行系统发育分析。分析所用全部序列见补充数据3–6。使用MAFFT v.7.518以默认参数进行多序列比对。使用FastTree v.2.2软件在默认设置下重建最大似然（ML）系统发育树。所得Newick格式树使用Interactive Tree Of Life（iTOL）在线平台（https://itol.embl.de/）进行可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant总RNA提取试剂盒提取总RNA（原文此处截断，后续步骤原文未详述）。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛烷二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，此前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，作者对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于气相色谱-质谱联用（GC–MS）的代谢物 profiling（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比较，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烷二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物的总离子流色谱图（TICs）和m/z 189提取离子流色谱图（EICs）在37.15分钟处显示一个显著未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法据此鉴定结构（图1D）。因此，作者对叶片中P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱测定其结构，鉴定为达玛烷-20,24-二烯-3β-醇（dammaradienol，达玛烷二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，作者使用市售人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3标准品进行靶向LC–MS分析。这三种人参皂苷在东北刺人参叶片或任何其他检测组织中均未检出（图1E–G和补充图9）。综上，这些发现表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛烷二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛烷二烯醇生物合成的基因组基础，作者生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率高达8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读段和126.91 Gb（约71×）Hi-C读段用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定到24条假染色体上的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得了功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，作者分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。基于145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高支持率分支：一个包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一个包含辽东楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。这一拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的亲缘关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B形成两个独立分支，分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚在一起，这与两者共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能源自一个二倍体五加科样祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群组的MCMCTREE分化时间估算（使用TimeTree化石校准）将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，两大五加科谱系的后续分离约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参亚基因组A和B的分化约在23.2百万年前，早于辽东楤木-人参属分支内的物种分化（图2B）。作者随后比较候选植物物种的基因组，以获取在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度表达，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。作者因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一次共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与V. vinifera之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源多倍体物种表现出二倍体物种中不存在的约0.1处额外Ks峰。每个异源多倍体内两个亚基因组之间的直系同源基因对也在约0.1处显示一个峰。与此模式一致，共线性分析揭示了V. vinifera、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在一次共享WGD之后发生了较近期的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛烷二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛烷二烯醇在东北刺人参叶片中积累，作者推测东北刺人参基因组编码一种特异性催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛烷二烯醇的氧化鲨烯环化酶（OSC）。为验证这一假设，作者使用已知人参OSC序列作为查询序列对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19；补充数据）。
OSC系统发育分析与功能表征
为确定东北刺人参OSC基因的系统发育位置和潜在功能，作者构建了包含功能鉴定的双子叶植物OSC以及来自V. vinifera、S. barbata、A. argyi、C. asiatica和8个五加科物种的全部预测OSC的最大似然系统发育树。OSC亚家族以不同颜色标示，右侧展示了BAS、mTTSs和DDS亚家族的放大视图及其产物（图4A）。OSC亚家族在V. vinifera、S. barbata、A. argyi、C. asiatica和8个五加科物种中的拷贝数分布显示左侧为物种系统发育树（图4B）。共线性分析揭示了OSC位点在这些物种间的微共线性关系（图4C）。
通过在本氏烟草叶片中瞬时共表达tHMGR与各OeOSC基因，作者对全部19个OeOSC进行了功能表征。GC–MS分析（m/z 189）显示不同OeOSC产生不同类型的三萜产物（图3B）。质谱碎裂谱图分析将OeOSC来源的四环三萜和五环三萜产物进行了分类（图3C、D）。功能表征结果总结于图3E，展示了OeOSC将2,3-氧化鲨烯酶促环化为β-香树脂醇、α-香树脂醇、羽扇豆醇、达玛烷二烯醇和达玛烷二醇II的催化活性。
OeOSC14的关键氨基酸位点突变分析
多序列比对显示OeOSC14与代表性OSC的活性位点残基（蓝色标记）和选择用于突变的位点（红色标记）（图5A）。作者对OeOSC14及SbχAS进行了定点突变实验。GC–MS分析（m/z 189）显示OeOSC14及其突变体在本氏烟草叶片中与tHMGR共表达后产生不同产物谱（图5B）。产物定量分析显示，OeOSC14、SbχAS及其变体以及PgχAS Y259N、OeOSC12 Y260N产生的三萜产量以柱状图展示（平均值±标准误，n = 3个生物学重复），绝对产量使用纯化标准品生成的标准曲线计算（图5C）。分子对接模型展示了达玛烷二烯醇与OeOSC14、OeOSC12、SbχAS及其各自变体（OeOSC14 N260Y、OeOSC12 Y260N和SbχAS Y259N）的复合物结构，显示mTTSs活性口袋内的空间相互作用。达玛烷二烯醇以粉色棒状表示，绿色和品红色标签分别指示位于配体5 Å以内和以外的氨基酸残基，原子间距离以红色虚线标记并标注数值（图5D）。
RK型人参皂苷生物合成通路的解析与重构
作者提出了东北刺人参和人参中RK型人参皂苷的生物合成路线图（图6A）。红色和蓝色线条分别指示人参和东北刺人参中的途径。GC–MS分析（m/z 202和m/z 187）显示东北刺人参叶片提取物中与真实标准品匹配的保留时间窗口以蓝色突出显示（图6B、C）。系统发育分析鉴定了负责达玛烷型皂苷C-12羟化和齐墩果烷型皂苷C-16羟化的CYP分支，以AcCYP716A111为根（图6D）。跨物种共线性分析揭示了人参、辽东楤木和东北刺人参之间C12-羟化酶CYP位点的共线性关系，红线指示CYP基因间的共线性关系，红色虚线表示缺乏完整CYP基因的共线性区块（图6E）。
为验证重构的RK型人参皂苷生物合成通路，作者在本氏烟草叶片中瞬时共表达tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2。GC–MS分析（m/z 202）检测到产物峰（蓝色标记）（图7A）。进一步共表达CYP和UGT后，LC–MS分析（m/z 665.430）检测到人参皂苷Rk3产物峰（橙色标记）（图7B）。LC–MS分析（m/z 649.435和811.488）检测到人参皂苷Rk2和Rk1产物峰（分别以绿色和蓝色标记）（图7C）。MS碎裂谱图确认了检测到的产物身份（图7D）。通过异源生物合成在本氏烟草中产生的人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3产量如图7E所示，误差线表示三个生物学重复的平均值和标准误。
讨论与解读
本研究通过染色体水平基因组组装和比较基因组学，揭示了东北刺人参中达玛烷二烯醇合酶OeOSC14的进化起源——由祖先多功能三萜合酶经复制和新功能化产生。单氨基酸替换N260Y即可将OeOSC14从达玛烷二烯醇特异性酶逆转为多功能三萜合酶，这一发现精确界定了功能转换的关键位点。研究同时证明C12羟化酶功能缺失是东北刺人参无法合成RK型人参皂苷的代谢障碍。在本氏烟草中重构完整通路实现Rk1、Rk2和Rk3的从头生产，为这类高价值化合物提供了不依赖人参资源的植物基生产途径。
编译者解读
该研究的亮点在于将进化基因组学与合成生物学有机结合——不仅解答了"达玛烷二烯醇合酶如何进化而来"的基础科学问题，更直接指导了"如何在异源植物中重构RK型人参皂苷通路"的应用实践。单点突变回复多功能性的发现为三萜合酶的理性设计提供了精准靶点。值得注意的是，本氏烟草瞬时表达系统虽验证了通路可行性，但实际产量仍有限（原文未给出具体产量数值），未来向稳定转基因体系或微生物细胞工厂的转化将是产业化关键。此外，东北刺人参基因组中丰富的OSC基因家族资源也为发掘其他高价值三萜化合物合成模块提供了宝贵基因库。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661