来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种环境友好的生物催化剂，可氧化多种有机化合物，在工业废水处理领域备受关注。本研究从嗜热地衣芽孢杆菌SO8菌株中，采用三步相分配法（TPP）纯化漆酶，该方法简单、快速、低成本且高效。在最优条件下（pH 9.0、叔丁醇比例1.0:1.0、70%硫酸铵），漆酶纯化5.65倍，回收率达102.07%，分子量约38.7 kDa。纯化后的漆酶在pH 9.0和70°C下活性最高，在宽pH和温度范围内保持约65%活性，并对酸性红27表现出最高38%的脱色效率。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧氧化还原酶；EC 1.10.3.2）是一种含四个铜离子的多酚氧化酶。在将氧气还原为水的过程中，这些酶催化单酚、二酚和多酚、芳香族化合物、有机污染物及无机底物的氧化。由于对多种酚类和非酚类化合物的氧化能力，漆酶是纺织、造纸木质素降解、污染物解毒、葡萄酒澄清、有机化学合成、生物传感器及酶生物燃料电池阴极反应中的重要工业酶。
漆酶结构中含有约15–40%的碳水化合物，这些糖基赋予酶高稳定性。漆酶单体的分子量在50–85 kDa之间，每个单体通常含四种类型的铜离子，广泛存在于真菌、植物、细菌和古菌中。细菌漆酶相比真菌和植物来源具有更宽的底物特异性、快速且经济的生产方式、更宽的最适pH范围、增强的热稳定性和耐碱性等优势。尽管细菌漆酶多样性的基因组知识不断扩展，但对其具体性质的研究仍然有限。
研究方法
菌株与化学试剂
本研究使用由Olmez等人从内夫谢希尔Kozaklı温泉分离的地衣芽孢杆菌SO8菌株（GenBank编号：MG076978）作为漆酶来源。所用全部化学试剂和溶剂均购自Merck（德国）和Sigma-Aldrich（美国）。
酶活与蛋白测定
漆酶活性采用改良自Wang等人（2014）的方法测定。简要步骤如下：0.5 mL酶溶液与1 mL含0.5 mM ABTS的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）在55°C下孵育15 min。以缓冲液代替酶溶液作为对照反应。酶活性通过分光光度法在420 nm波长下监测ABTS的氧化来确定。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 µmol ABTS所需的酶量。活性计算按照Baltierra Trejo等人（2015）描述的公式进行。蛋白质浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。
漆酶的纯化
培养液中的细菌细胞与漆酶一起通过离心（6000 rpm，15 min，4°C）去除。获得的匀浆用作TPP的酶源。在漆酶纯化中，首先为达到最高纯化效率，对硫酸铵浓度（20–80% w/v）、匀浆/叔丁醇比例（1.0:0.5、1.0:1.0、1.0:1.5、1.0:2.0 v/v）和pH（2.0–11.0）等参数进行TPP纯化优化。TPP过程中，首先将不同浓度的硫酸铵加入2 mL匀浆中并缓慢涡旋混合，然后按不同比例加入叔丁醇并涡旋30 s。混合物在室温下孵育1 h，然后以6000 rpm离心5 min。离心后观察到三相形成，去除上相中的叔丁醇，随后立即将中间相和下相水相分别收集到不同试管中。对中间相和下相水相进行漆酶活性和总蛋白浓度分析。中间相中的蛋白质沉淀用0.1 M pH 7.0磷酸钠缓冲液溶解。确定硫酸铵和叔丁醇比例后，将匀浆（2 mL）用70%硫酸铵饱和，并用1 M NaOH和1 M HCl调节至不同pH（pH 2.0–11.0），然后加入叔丁醇。按下相和中间相的漆酶活性和蛋白质含量按上述方法测定。绘制表示活性回收率（%）相对于纯化倍数的图表。
SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析确定TPP法部分纯化漆酶的纯度和分子量。电泳过程使用12%（w/v）分离胶和4%（w/v）浓缩胶，基于Laemmli（1970）方法。每孔上样20微升样品。凝胶电泳过程先在250 V下运行5–10 min以确保浓缩阶段，然后在120 V下约90 min使蛋白质在分离胶中分离。蛋白条带通过银染20 min显现。蛋白质分子量标记物（ECOTECH）用作标准品。
纯化漆酶的表征
pH和温度的影响
为确定纯化漆酶的最适pH，在pH 2至12范围的0.1 M缓冲液中评估酶活性。所用缓冲液包括甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.0–3.0）、乙酸钠缓冲液（pH 4.0–5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 10.0–11.0）。为确定纯化漆酶的最适温度，在20至90°C温度范围内进行酶活性测量。显示最高活性的pH和温度值视为100%用于相对活性计算。为评估pH稳定性，将0.5 mL漆酶在指定范围内不同pH值的缓冲液中孵育2 h。然后测量残余活性，初始活性设为100%。热稳定性通过将酶在20°C至90°C温度范围内孵育30、60、90和120 min来评估。在最适pH（pH 5.0）下使用1.5 mL缓冲液、1 mL底物和0.5 mL酶溶液测定残余活性。初始活性视为100%用于相对活性计算。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
为研究某些金属离子对漆酶的影响，使用20 mM的金属离子溶液（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺），将0.5 mL纯化漆酶加入各金属离子中使最终浓度为1、5和10 mM，孵育30 min，然后测定剩余漆酶活性。以不含任何金属盐的酶活性作为100%对照。类似地，研究不同表面活性剂和抑制剂对漆酶的影响：Triton X-100、Tween-20、Tween-80浓度分别为1%、5%和10%，SDS浓度为5、10和20 mM，以及NaF和EDTA。孵育结束后，以初始活性为100%测定漆酶的残余活性。
底物特异性
使用各种酚类（愈创木酚、鞣酸和L-酪氨酸）和非酚类（ABTS）底物测定从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的底物特异性。ABTS底物溶液用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）配制，愈创木酚和鞣酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制，L-酪氨酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制。漆酶活性最高的底物活性视为100，其他底物的相对活性（%）按此计算。
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测量了50–1000 µM范围内不同浓度ABTS底物的活性。用所得值绘制Lineweaver-Burk图，利用该图计算Km、Vmax、Kcat和催化效率（Kcat/Km）。
染料脱色
反应混合物由0.5 mL染料溶液、0.5 mL漆酶和1 mL 0.5 mM ABTS介体溶液组成。然后将该混合物在55°C下孵育15、30、60和120 min，每次孵育在不同初始pH值（5.0、7.0和9.0）下进行。孵育结束时的剩余染料浓度在最佳波长下用分光光度法分析。染料脱色百分比按以下公式计算：脱色率(%) = [(Ci − Ct)/Ci] × 100。其中Ci为染料的初始浓度，Ct为剩余染料浓度。
统计分析
所有涉及从地衣芽孢杆菌SO8分离的漆酶的实验均进行三次重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示，代表三次独立实验的平均值和变异性。漆酶表征数据的统计分析使用GraphPad Prism®软件（版本9.0，GraphPad Software，San Diego，CA）进行Student双尾t检验。
研究结果
酶的分离与纯化
为获得耐受极端条件的漆酶，选择本实验室先前分离和鉴定的耐热菌中活性最高的地衣芽孢杆菌SO8细菌。TPP作为一种简单、快速、一步式生物分离技术，被用于从细菌液体培养物中纯化漆酶，以替代昂贵、耗时、多步骤的传统方法。首先，为以最高产率纯化从地衣芽孢杆菌SO8菌株分离的漆酶，对叔丁醇、硫酸铵、pH和比例等参数进行了优化。优化纯化条件对于实现高酶纯度和产率至关重要。图1显示了各参数对匀浆中漆酶纯化系数和产率的影响。确定最佳条件为70%（w/v）硫酸铵浓度、1.0:1.0匀浆溶液：叔丁醇比例和pH 9.0，实现5.65倍纯化和102.07%的产率。在优化条件下，TPP有效纯化了地衣芽孢杆菌SO8粗提液中的漆酶，实现了102.07%的产率和5.65倍纯化。叔丁醇浓度的增加导致有机相中水吸收增加，提高水相盐度，从而促进蛋白质在界面沉淀。漆酶在TPP过程中通常分配至界面相。产率超过100%是TPP方法在纯化过程中去除抑制剂和激活酶的能力所致。此外，TPP过程中使用的硫酸铵和叔丁醇的联合效应可引起酶三维构象的积极变化，使其转变为更活跃的结构。
表1总结了使用TPP纯化SO8漆酶的整体纯化情况。粗提液总活性为72.446 EU/mL，总蛋白0.520 mg/mL，比活139.32 EU/mg，回收率100%，纯化倍数1；TPP界面相总活性73.948 EU/mL，总蛋白0.094 mg/mL，比活786.68 EU/mg，回收率102.07%，纯化倍数5.65；TPP水相总活性31.08 EU/mL，总蛋白0.256 mg/mL，比活121.4 EU/mg，回收率42.9%，纯化倍数0.87。
先前研究已证明TPP适用于漆酶的高产率纯化。例如，一项研究报告了Pleurotus ostreatus漆酶的27.8倍纯化和161%产率。Rajeeva和Lele（2011）使用两阶段TPP对Ganoderma sp.漆酶实现了60%产率和13.1倍纯度。Liu等人报道了TPP纯化漆酶的20倍纯度和约75%产率。与其他常用方法相比——如硫酸铵沉淀-固定化金属亲和层析（Pleurotus ostreatus漆酶46倍纯化、57.4%产率）、渗滤（Ganoderma sp.漆酶3.7倍纯化、90.4%产率）和超滤（Pycnoporus sp.漆酶2.14倍纯化、87%产率）——TPP通常表现出优越的纯化产率。TPP是一种新兴的蛋白质沉淀生物分离技术，可实现高效的酶纯化和回收。与传统层析方法相比，TPP在蛋白酶和淀粉酶等酶的更高纯度方面显示出潜力。TPP因其多功能性而日益受到认可，现广泛用于各工业领域的蛋白质回收。
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析证实了TPP对漆酶纯化的有效性（图2）。与粗酶提取物（泳道a）和水相（泳道b）相比，仅在中间相（泳道c）观察到单一蛋白条带。这一观察强烈表明TPP有效去除了污染蛋白和其他分子，使中间相富集了目标漆酶。基于SDS-PAGE分析，纯化的地衣芽孢杆菌SO8漆酶的分子量约为38.7 kDa。该分子量落在其他细菌物种漆酶的报道范围内，如B. tequilensis SN4漆酶32 kDa、Enterococcus faecium A2漆酶50.11 kDa和Arthrobacter gonensis P39漆酶160 kDa。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的最适pH确定为9.0，表明其为碱性酶（图3A）。漆酶在宽pH范围（pH 2.0–11.0）内保持超过50%的活性（图3B）。观察到从SO8菌株分离的漆酶在高pH值下保持稳定，在所有pH值下120 min结束时保留超过35%的活性。在高pH值下显示活性并保持稳定的漆酶在工业上需求量很大。虽然在60 min时观察到相对活性下降，但120 min时相对活性的恢复和增加表明酶对极端条件的抗性，代表初始环境胁迫后的结构恢复和激活过程。来自链霉菌和Thioalkalivibrio的耐碱漆酶大多源自芽孢杆菌属物种。
为确定地衣芽孢杆菌SO8漆酶的温度谱和稳定性，在20°C至90°C温度范围内进行研究，结果显示在70°C时活性最大，在20–90°C范围内具有高活性（图3C）。漆酶的活性测量在20°C至90°C温度范围内以周期性间隔进行120 min。观察到漆酶在所有研究温度下2 h孵育期间显著保持其活性（图3D）。漆酶的高耐热性是其进化适应的结果，这得益于其含有的致密碳水化合物基团、强二级结构键，尤其是其细菌来源。在这些温度范围内长时间不失去活性很重要，因为纺织厂的废水可能处于高温状态。冷却水既需要时间又需要资源。先前研究已证明来自不同来源的漆酶存在显著的热不稳定性。例如，Koschorreck等人（2008）报道一种真菌漆酶在70°C下2 h后活性损失92%，而Halaburgi等人（2011）观察到C. cladosporioides漆酶在80°C下5 min内活性损失52%。相比之下，地衣芽孢杆菌SO8漆酶表现出 exceptional 的热稳定性。这种显著的稳定性表明其对高温具有高耐受性和宽操作温度范围。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
研究了各种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶活性的影响。在1和5 mM浓度的Fe²⁺和Mn²⁺离子存在下，漆酶活性增加。在其他金属离子存在下，酶活性受到不同程度的影响。
表面活性剂和抑制剂的影响如表2所示。Triton X-100在1%浓度下残余活性为82.26 ± 2.65%，5%时为41.72 ± 5.85%，10%时为19.92 ± 0.489%。Tween-20在1%时为100.3 ± 1.495%，5%时为98.39 ± 7.159%，10%时为40.79 ± 0.233%。Tween-80在1%时为119.9 ± 18.87%，5%时为103.2 ± 11.36%，10%时为41.72 ± 3.527%。SDS在5 mM时残余活性为100.8 ± 3.604%，10 mM时为92.83 ± 4.404%，20 mM时为58.97 ± 8.414%。NaF在5 mM时为90.54 ± 3.871%，10 mM时为79.93 ± 0.998%，20 mM时为60.61 ± 8.159%。EDTA在5 mM时为114.1 ± 13.40%，10 mM时为82.97 ± 1.710%，20 mM时为49.65 ± 1.456%。
酶动力学
通过Lineweaver-Burk图确定了ABTS底物的动力学参数。Km为110 µM，Vmax为19.6 µmol L⁻¹ min⁻¹，kcat为0.048 s⁻¹，kcat/Km为0.44 s⁻¹ mM⁻¹。
染料脱色
染料脱色实验表明中等程度的去除效率，在pH 5、7和9条件下120 min孵育中，酸性红27的脱色率最高达38%。
讨论与解读
本研究成功采用三步相分配法（TPP）从地衣芽孢杆菌SO8中一步纯化漆酶。TPP被证明是一种快速、经济且高效的替代方法，实现了5.65倍纯化和102%的产率。纯化的漆酶在宽pH范围（2.0–11.0）和温度范围（20–90°C）内表现出显著的稳定性。值得注意的是，它在高温下保留了92%的活性，超过了文献中报道的许多细菌漆酶的热稳定性。此外，该酶对多种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）、化学物质/抑制剂（NaF和EDTA）和表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-80）表现出显著的耐受性。这种稳健的稳定性，加上其广泛的活性谱和脱色潜力，使地衣芽孢杆菌SO8漆酶成为多种工业应用（特别是生物修复）的有前景候选者。
编译者解读
本研究选择TPP这一非层析纯化路线，契合合成生物学中"低成本、可放大"的酶制剂生产理念。TPP将硫酸铵沉淀与有机溶剂萃取合为一步，在回收率超过100%的同时简化了操作链条，这对工业放大具有直接吸引力。38.7 kDa的分子量低于典型真菌漆酶，提示该酶可能属于细菌漆酶家族中的小型成员，其碱性pH偏好和高温耐受性为纺织废水等高温高碱场景提供了匹配性。不过，脱色率仅38%说明该酶在实际废水处理中可能需要介体系统或酶工程改造来提升效率。后续工作可在表达水平优化和底物口袋理性设计上发力。
参考来源
Yıldırgan S, Aygün E, Altintas R, Şişecioğlu M. Purification of laccase from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 with three-phase partitioning, characterization, and usage in dye decolorization. 3 Biotech. PMID: 42179929.
PMID: 42179929