来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷骨架的高价值活性物质，但栽培人参中并不天然产生。本研究通过染色体水平基因组组装、比较基因组学与生化分析，发现东北刺人参中的OeOSC14是特化的达玛二烯醇合酶，由祖先多功能三萜合酶经复制和功能新化演化而来。单个N260Y氨基酸替换即可使OeOSC14从达玛二烯醇专一性酶逆转为多功能三萜合酶。研究还揭示C12羟化酶功能缺失阻断了RK型人参皂苷生物合成的下游氧化步骤，并在本氏烟草中重构了Rk1、Rk2和Rk3的从头生物合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为母核、经糖基修饰形成的重要特化代谢物，已报道的结构超过20,000种。它们在植物抵御病虫害、塑造根际微生物组及影响作物品质方面发挥生态功能，同时具有免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性。人参属（Panax）植物所含人参皂苷以达玛烷骨架为主，在C-3、C-6和/或C-20位发生多样化糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2、Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，相对母体化合物疏水性增强。与新鲜人参组织中占主导的普通人参皂苷不同，RK型人参皂苷在栽培人参中基本不产生，通常通过热处理或酸处理（如红参加工蒸制）过程中的逐步脱糖反应获得。东北刺人参（Oplopanax elatus）作为人参近缘种，能够积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，但本身并不产生RK型人参皂苷，这为解析该类化合物的生物合成与演化提供了独特体系。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用一株健康东北刺人参（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培群体。该群体种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘保持根系完整，快速清理后立即投入液氮冷冻，于−80 °C保存备用。各组织类型的外观如图1B所示。采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为产生PacBio HiFi长读长数据，共取15 µg高分子量DNA，使用gTUBE剪切，随后采用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统进行大小选择，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi一致性序列在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程后，Hi-C文库在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量控制
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读段结合Hi-C数据进行组装。首先，原始Hi-C数据经SOAPnuke v.1.5.3过滤获得高质量干净读段（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读段使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定至染色体，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）进行Hi-C数据的过滤、排序和定向。最终，使用Juicebox v.1.11.08对组装结果进行人工校正，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性通过BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用从头预测与同源比对相结合的策略。首先，使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后应用RepeatMasker结合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask针对Repbase数据库注释已知重复元件。此外，利用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种蛋白序列用TBLASTN v.2.2.31+（E-value < 1e-5）比对至组装基因组，随后用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果及对应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，再基于同源预测的基因结构训练HMM模型，随后用Augustus v.3.5.0根据训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，RNA-seq数据先用HISAT2 v.2.2.1比对至基因组，比对读段用StringTie v.2.2.0组装为转录本，剪接位点经PASA_lite v.0.1.0验证并进一步优化转录本模型。最后，三种方法预测的基因模型用MAKER2整合生成高质量基因集。功能注释方面，预测基因的蛋白序列与SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库进行BLASTP比对（E-value < 1e-10），基于最佳BLASTP命中结果分配功能注释。
基因组演化分析
比较基因组分析使用东北刺人参及18种其他植物：V. vinifera、拟南芥、毛果杨、A. elata、P. stipuleanatus、三七、西洋参、人参、P. japonicus、E. senticosus、胡萝卜、芹菜、芫荽、向日葵、中粒咖啡、番茄、二穗短柄草、水稻。基因家族用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类。为推断系统发育关系，基于鉴定的单拷贝基因家族提取4D简并位点，用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然系统发育树，1000次bootstrap重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的4D位点进一步用于PAML v4.9j包中MCMCTree程序估算物种分化时间。分化时间在贝叶斯框架下用马尔可夫链蒙特卡洛算法推断，MCMCTree参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库的分化时间。基因家族扩张与收缩用CAFE v.4.2分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
种内旁系同源基因对方面，先用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，区块内基因对的Ks值用PAML中codeml在F3X4模型下计算。种间直系同源基因对通过BLASTP（E-value < 1e-5）鉴定，基于bit-score和E-value排序选择最佳命中基因对，用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2，基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT）在东北刺人参中进行，E-value阈值<0.01。预测蛋白序列用SeqKit v.2.6.1软件按长度过滤：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员用在线工具Conserved Domain Database（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进一步验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定亚家族分类，使用已报道功能的植物基因序列与东北刺人参预测家族成员一起进行系统发育分析。所有分析所用序列列于补充数据3–6。多序列比对用MAFFT v.7.518以默认参数进行。最大似然系统发育树用FastTree v.2.2软件默认设置构建。Newick格式的结果树用iTOL在线平台（https://itol.embl.de/）可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant RNA Kit提取总RNA。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，此前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜类化合物。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，我们对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物的总离子流色谱图和m/z 189提取离子流色谱图在37.15分钟处显示一个显著未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法通过质谱直接鉴定结构（图1D）；因此，我们从叶片中进行大规模提取、分离和纯化P1，并通过核磁共振波谱确定其结构为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，我们使用Rk1、Rk2和Rk3人参皂苷的商业化标准品进行靶向LC-MS分析。三种人参皂苷在东北刺人参叶片或任何其他检测组织中均未检出（图1E-G和补充图9）。综上，这些结果表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，我们生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参的单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率为8.5%（补充图10）。共产生45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读段和126.91 Gb（约71×）Hi-C读段用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含两个单倍型锚定至24条假染色体，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定重复序列覆盖组装的63.68%，预测61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6-9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的演化历史和东北刺人参的系统发育位置，我们分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个强支持分支：一支包含刺五加和东北刺人参，另一支包含Aralia elata及5个人参属物种。该拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与A. elata或人参属更为密切。值得注意的是，刺五加的A和B亚基因组分别形成两个独立分支，并分别与东北刺人参的A和B亚基因组聚类，这与两者共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种中也观察到类似的二亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和A. elata）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能来源于一个二倍体五加科样祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群的MCMCTREE分化时间估算（以TimeTree化石校准）将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，两个主要五加科谱系的随后分离约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参的A和B亚基因组约在23.2百万年前分化，早于A. elata-人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种基因组以获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度代表，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动因素。我们因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和A. elata中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks ≈ 0.3处的共享峰指示共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断得到二倍体五加科基因组（如三七和A. elata）与Vitis vinifera之间2:1共线性关系的进一步支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种表现出二倍体物种中不存在的约0.1处额外Ks峰。每个异源四倍体两个亚基因组之间的直系同源基因对也在约0.1处显示峰。与此模式一致，共线性分析揭示了V. vinifera、A. elata、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在共享WGD之后发生了相对较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，我们假设东北刺人参基因组编码一种特异性催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛二烯醇的氧化鲨烯环化酶（OSC）。为验证该假设，我们使用已知人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
通过系统发育分析，将这些OSC基因分类到不同亚家族。其中OeOSC14与已知的多功能三萜合酶聚为一支，但功能验证显示其特异性催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛二烯醇，而非其他三萜产物（图3）。在本氏烟草中瞬时共表达tHMGR与各OeOSC基因后，GC-MS分析显示OeOSC14的产物谱以达玛二烯醇为主峰（图3B）。质谱碎裂谱进一步确认了OeOSC14产物的达玛烷型四环三萜结构（图3C）。相比之下，其他OeOSC成员如OeOSC12则产生包括β-香树脂醇、α-香树脂醇和羽扇豆醇在内的多种三萜产物（图3D-E），表明OeOSC14经历了从多功能到单功能的演化转变。
OSC基因家族的比较基因组学分析
为解析OeOSC14的演化起源，我们对双子叶植物OSC基因家族进行了大规模系统发育分析，涵盖V. vinifera、半枝莲、艾草、积雪草及8个五加科物种的全部预测OSC。结果显示，BAS、mTTS和DDS三个亚家族在不同物种间拷贝数差异显著（图4A-B）。共线性分析揭示OSC位点在五加科物种间存在广泛的微共线性区块（图4C）。功能验证显示，来自人参、刺五加和半枝莲的代表性mTTS成员均以达玛烯二醇II为主要产物（图4D），而东北刺人参的OeOSC14则特异性产生达玛二烯醇，提示该功能特化是五加科谱系中相对近期的事件。
OeOSC14功能特化的分子机制
多序列比对显示OeOSC14与其他OSC在活性位点残基上存在关键差异（图5A）。为验证这些残基的功能意义，我们构建了系列突变体并在本氏烟草中瞬时表达分析。结果发现，N260Y单氨基酸替换即可使OeOSC14从达玛二烯醇专一性酶逆转为多功能三萜合酶，重新获得产生β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II的能力（图5B-C）。相反，将OeOSC12的Y260突变为N（Y260N）则使其从多功能合酶转变为达玛二烯醇专一性合酶（图5C）。分子对接模型进一步揭示了第260位氨基酸残基在底物通道和产物特异性的空间调控作用（图5D）：当该位点为酪氨酸时，其侧链与达玛烯二醇II的C20位距离较近，限制了产物从活性口袋的释放方式，从而改变了环化产物的选择性。
RK型人参皂苷生物合成途径的重构
为阐明东北刺人参中RK型人参皂苷缺失的分子机制，我们对C12羟化酶基因家族进行了系统发育和共线性分析（图6A-D）。结果显示，东北刺人参基因组中CYP716A47直系同源基因（OeCYP）发生了功能缺失突变，导致无法催化达玛烷骨架C12位羟化——这是RK型人参皂苷生物合成的关键下游氧化步骤（图6E）。跨物种共线性分析进一步证实了该基因座的缺失事件（图6E）。
基于以上发现，我们在本氏烟草中重构了RK型人参皂苷的完整生物合成途径。将tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2共表达后，GC-MS检测到与标准品保留时间一致的产物峰（图7A）。进一步加入UGT基因后，LC-MS分析检测到人参皂苷Rk3（m/z 665.430）、Rk2（m/z 649.435）和Rk1（m/z 811.488）的产物峰（图7B-C），MS碎裂谱与标准品一致（图7D）。定量分析显示，Rk1、Rk2和Rk3在本氏烟草中的异源生物合成产量分别为0.42、0.58和0.35 µg/g鲜重（图7E）。
讨论与解读
本研究发现东北刺人参通过OSC基因的复制和功能新化演化出达玛二烯醇专一性合酶OeOSC14，单个N260Y替换即可逆转该功能特化，揭示了三萜合酶产物多样性演化的分子机制。同时，C12羟化酶的功能缺失解释了东北刺人参积累前体却不产生RK型人参皂苷的现象。在烟草中成功重构Rk1-Rk3的从头合成，为这类高价值脱水人参皂苷提供了不依赖红参加工过程的植物生产平台。
编译者解读
该研究巧妙利用近缘物种的天然"半成品"代谢状态，将基因组演化和生化机制解析相结合，为合成生物学提供了清晰的路径设计逻辑——先找到特化酶，再解锁缺失步骤，最后异源重构。N260Y单点突变的功能逆转是亮点，提示三萜合酶产物特异性可能由少数关键残基决定，这为酶工程改造提供了精准靶点。不过，烟草中重构产量仍处于µg级水平，距离产业化还有距离；后续若能在酵母或更高产植物底盘中进行通路优化与发酵放大，或可推动RK型人参皂苷的可持续生产。该策略对其它珍稀三萜皂苷的异源合成也具有借鉴意义。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661