来源：J Genet Eng Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
1,4-丁二胺（腐胺）是聚酰胺产业的重要单体，微生物发酵法生产正逐步替代高污染的化学合成路线。然而，大肠杆菌内源合成途径长、代谢通量分配不均，产量提升常伴随细胞生长受抑。Sun等人将整个合成途径拆解为“丁二胺生产模块”与“α-酮戊二酸生产模块”，通过模块内基因过表达与模块间通量平衡，在E. coli MG1655中系统性地强化了1,4-丁二胺的生物合成。这项发表于Journal of Genetic Engineering and Biotechnology的研究，以同四聚酶（homotetrameric enzyme）介导的多基因串联策略为技术核心，展示了模块化代谢工程在复杂途径重构中的实用价值。
研究背景
1,4-丁二胺的微生物合成路径横跨三羧酸循环（TCA）、鸟氨酸代谢与脱羧反应等多个代谢区块。在大肠杆菌中，这条途径冗长且与细胞生长必需的氨基酸代谢深度耦合——改变某一节点往往牵动全局通量再分配。传统“单基因敲除+单基因过表达”策略难以兼顾多个限速步骤，容易造成中间代谢物积累或辅因子失衡。
模块化代谢工程为此提供了另一种思路：将长途径按功能拆分为相对独立的模块，先分别强化各模块的催化能力，再通过模块间的协同优化实现整体通量提升。Sun等人将1,4-丁二胺合成途径划分为生产模块（module 1）和α-酮戊二酸供给模块（module 2），前者负责从鸟氨酸到丁二胺的转化，后者则聚焦于TCA循环中α-酮戊二酸的生成。这种划分的逻辑在于——丁二胺的碳骨架全部来自α-酮戊二酸，供给模块的强度直接决定生产模块的原料天花板。
研究方法
菌株与培养条件。 研究选用E. coli MG1655和E. coli BL21(DE3)作为合成1,4-丁二胺的底盘菌株，E. coli JM109则作为质粒构建的克隆宿主。菌株与质粒构建阶段，细胞培养于含相应抗生素的LB固体平板。抗生素使用浓度如下：卡那霉素50 mg/mL、氨苄青霉素80 mg/mL、氯霉素25 mg/mL、链霉素50 mg/mL。目标基因以匹配引物从相关宿主基因组DNA扩增获得；异源基因则以E. coli MG1655和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）13032基因组为模板扩增。研究所用质粒和菌株列于补充表1，引物列于补充表2。
质粒构建。 pRSM3载体经Nde I和Kpn I或Xho I双酶切后，与具有相同粘性末端的靶片段连接，构建pRSM3表达质粒。pACM4、pCDM4、pRSM3和pETM6四个质粒均含有Bln I、Xba I、Nhe I和Spe I四个重要酶切位点。这四个限制性内切酶的识别序列均产生CTAG粘性末端，因此被称为同四聚酶（homotetrameric enzymes）。在多基因串联构建过程中，待过表达基因首先通过Nde I和Xho I位点克隆入原始质粒，随后选取其中一个质粒作为载体进行后续操作——原文摘要未详述同四聚酶串联的具体连接轮次与温育时间。
丁二胺生产模块的代谢改造。 依据E. coli代谢途径分析，为促进1,4-丁二胺合成，研究聚焦于过表达gdhA、argB、argC、argD、argJ和ODC10六个基因。其中argJ为谷氨酸棒杆菌来源密码子优化版本，ODC10为筛选获得的异源鸟氨酸脱羧酶基因。研究首先构建了pRSM3-gdhA、pRSM3-argCB、pRSM3-argD、pRSM3-argJ*和pRSM3-ODC10单基因表达质粒（原文图3-2a），并转化至底盘菌株。
研究结果
单基因过表达筛选。 在丁二胺生产模块中逐一过表达上述基因后，各菌株的1,4-丁二胺产量呈现明显差异。原文图3-2展示了各单基因过表达菌株的产量对比——具体产量数值原文摘要未提供。值得关注的是，不同基因的过表达效果差异显著，这提示鸟氨酸途径中的限速步骤并非单一节点，而是多个酶共同控制通量。
多基因串联与模块协同。 在单基因筛选基础上，研究利用同四聚酶系统将多个效应基因串联至同一表达框，实现模块内多基因的协同过表达。同时，针对α-酮戊二酸供给模块（module 2），研究对TCA循环相关基因进行了系统改造——原文摘要未详述该模块涉及的具体基因名单及过表达组合方式。模块化改造的核心逻辑在于：生产模块的过表达会大量消耗α-酮戊二酸，若无供给模块的同步强化，前体供应将成为新的瓶颈；反之，若供给模块过强而生产模块不足，则碳流可能滞留在TCA循环中。原文图3-1展示了E. coli中1,4-丁二胺的完整代谢途径及各基因在途径中的位置。
产量与转化效率。 原文摘要未提供最终菌株的1,4-丁二胺产量、产率或转化率的具体数值。但从研究设计推断，模块化改造的成效体现在两个方面：一是通过生产模块的多基因串联过表达解除下游限速；二是通过供给模块的强化维持前体池的充足供应。两个模块的协同优化使得代谢通量向目标产物方向高效流动，同时减少中间代谢物的积累对细胞造成的毒性压力。
讨论与展望
这项研究的核心价值在于方法学层面。同四聚酶系统允许在一个质粒上串联多个基因，且串联顺序和拷贝数可灵活调整——这为模块内多基因的剂量优化提供了便利。相比传统的多质粒共转化或染色体整合策略，同四聚酶串联在表达均一性和遗传稳定性方面具有潜在优势。
另一个值得注意的设计思路是将α-酮戊二酸供给独立成模块。多数丁二胺合成研究聚焦于下游脱羧步骤，而对上游TCA循环的通量供给关注不足。Sun等人的模块划分提示：当生产模块的催化潜力被充分释放后，前体供给往往成为新的限速因素。这种“先强化下游，再补足上游”的序贯优化策略，对其它依赖TCA循环中间产物的化学品生物合成具有参考意义。
当然，研究仍留有拓展空间。原文摘要未提供发酵条件优化（如pH调控、溶氧控制、诱导时机等）的信息，也未涉及放大生产的经济性评估。模块化改造后的菌株在工业发酵罐中的表现，以及两个模块基因表达的最优配比，均有待进一步探索。此外，ODC10作为筛选获得的异源脱羧酶，其动力学特性和辅因子偏好性也值得深入研究——这或许能解释为何该酶在单基因过表达中表现优于内源同工酶。
PMCID: PMC13449784