来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
乳酸菌的细胞壁厚、转化效率低，还自带限制修饰系统“防御外敌”——这些特性让它的基因编辑长期是块硬骨头。一项最新研究把CRISPR/Cas9系统搬进植物乳杆菌，通过系统性优化电转化条件和编辑流程，成功敲除了细菌素合成通路中的关键负调控基因plnD。改造后的菌株不仅plnA、plnE、plnF表达上调，抑菌活性也明显增强。该成果发表在Journal of Biological Engineering上，为乳酸菌的理性工程改造提供了一套可复用的操作方案。
研究背景
乳酸菌（LAB）是食品发酵和益生菌产业的核心菌种，其中植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）因能产生多种抗菌肽——细菌素而备受关注。植物乳杆菌8P-A3分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum，其基因组中含有一个完整的plantaricin（片球菌素）生物合成基因簇，受群体感应（QS）网络调控。在这个网络里，plnD编码的组氨酸蛋白激酶扮演“刹车”角色：它感知外界信号后，通过磷酸化级联抑制下游plnA、plnE、plnF等结构基因的表达。
想提高细菌素产量，最直接的思路就是拆掉这个“刹车”。但实际操作远非易事——乳酸菌的肽聚糖细胞壁厚实，外源DNA难以进入；不同菌株的限制修饰系统会降解外来质粒；Cas9蛋白引发的双链断裂（DSB）对乳酸菌往往是致命的，因为其同源重组修复（HDR）效率低下。这些障碍叠加在一起，让CRISPR/Cas9在乳酸菌中的应用远不如在大肠杆菌中那般顺手。
本研究的目标很明确：以plnD为靶点，在8P-A3菌株中建立一套经过优化的CRISPR/Cas9基因编辑平台。作者没有回避转化效率低、Cas9毒性强等老问题，而是从电转化条件、质粒设计到编辑后质粒清除，步步为营，逐一攻克。
研究方法
菌株与培养条件
实验所用植物乳杆菌8P-A3由俄罗斯实验医学研究所的Alexander Suvorov博士惠赠，最初分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum。菌株在MRS培养基（pH 5.7，Carl Roth GmbH，货号HP64.1）中培养。常规培养时，添加适当抗生素的MRS培养基，37°C、150 rpm振荡培养12–16小时，厌氧条件由BD GasPak™ EZ产气袋系统（货号260683）维持。固体培养基使用MRS Agar（Carl Roth GmbH，货号HP65.1）。
电转化感受态制备
制备电转感受态细胞需要两种关键溶液。MRS-G（MRS-甘氨酸）溶液的配制方法：在25 mL MRS肉汤中加入0.625 g甘氨酸，配成2.5%浓度，再用0.22 μm滤膜过滤除菌。甘氨酸的作用是削弱细胞壁的肽聚糖交联，让外源DNA更容易穿过这层物理屏障。SacGly溶液则是将85.55 g蔗糖溶解于400 mL水中，再加入100 mL 50%甘油，用于洗涤和重悬细胞，提供高渗保护。
电击后的细胞复苏使用MMRS（modified-MRS）培养基——在MRS肉汤中添加500 mM蔗糖、20 mM MgCl₂和2 mM CaCl₂。高渗蔗糖帮助受损细胞膜恢复，二价阳离子则可能参与膜修复和DNA摄入过程。电转仪器为Bio-Rad MicroPulser Electroporator（货号1652100），电转杯为0.1 cm间隙的Gene Pulser/MicroPulser电转杯（货号1652093）。
双质粒CRISPR/Cas9系统设计
编辑系统采用双质粒策略。CR质粒（pCB578）负责表达SpCas9蛋白、tracrRNA以及repeat-spacer-repeat（R-S-R）阵列——这个阵列中的间隔序列（spacer）决定了靶向特异性。RT质粒（pCB591）则携带供体修复模板，即plnD基因的内部删除/突变序列，用于引导HDR修复。两个质粒分别携带不同的抗生素抗性标记，便于后续的逐次转化和筛选。
质粒构建完成后，通过菌落PCR（cPCR）、限制性酶切和Sanger测序验证其正确组装。验证无误后，两个质粒依次电转入8P-A3菌株，获得CRM（CRISPR-modified）菌株。
基因编辑与质粒清除
编辑完成后，让菌株在不含抗生素的培养基中连续传代，使质粒自然丢失。通过筛选对红霉素和氯霉素均敏感的菌落，确认两个质粒均已成功清除——这步设计很巧妙：抗生素敏感性本身就是质粒丢失的直接证据，省去了额外的分子检测步骤。
编辑验证
验证分三个层次。第一层：用跨越plnA–plnD全座位的引物进行PCR扩增，比较CRM菌株与野生型（WT）菌株的扩增产物大小。若plnD内部发生删除，CRM菌株的扩增产物应显著短于WT。第二层：靶向扩增子测序，获得核苷酸级别的编辑确认。第三层：使用Geneious Prime、Benchling、SnapGene等多个独立平台进行高严格度序列比对，交叉验证编辑结果。
原文摘要未详述的具体参数：电转化的具体电压、电阻、电容参数，以及CR质粒和RT质粒的具体拷贝数、启动子元件等细节，摘要中未提供。
研究结果
双质粒系统成功构建
CR质粒pCB578和RT质粒pCB591的组装均通过cPCR、酶切和Sanger测序确认无误。两个质粒的R-S-R阵列、SpCas9表达框和供体模板序列均与设计一致。
plnD基因编辑成功
经过CRISPR/Cas9编辑和连续传代筛选，研究者获得了携带plnD内部删除/突变的CRM菌株。这些菌落对红霉素和氯霉素均敏感，证明两个质粒已被成功清除——这一步很关键，因为残留质粒会持续表达Cas9，可能导致脱靶效应或细胞毒性。
PCR扩增plnA–plnD全座位的结果显示，CRM菌株的扩增产物明显短于WT菌株（Fig. 5B）。这个长度差异与plnD内部删除的预期一致，是编辑成功的直接分子证据。
靶向扩增子测序提供了更精细的确认（Fig. 5A）。Geneious Prime、Benchling、SnapGene三个独立平台的比对结果完全一致，均显示HDR介导的删除连接点（deletion junction）存在于plnD基因区域内，同时该区域还伴随少量碱基突变。更重要的是，CRM等位基因同时丢失了完整的20 nt间隔序列识别位点及其相邻的5′-NGG PAM基序——这意味着即使残留的Cas9蛋白再次表达，也无法识别这个已被破坏的靶位点，从根本上杜绝了重复切割的可能性。
编辑对基因表达的影响
plnD是plantaricin群体感应网络中的负调控基因。敲除plnD后，下游结构基因plnA、plnE、plnF的表达均出现上调。这三个基因分别编码plantaricin的前体肽和加工转运相关蛋白，它们的上调直接指向细菌素合成通路的激活。
抗菌活性增强
与基因表达上调相对应，CRM菌株的抗菌活性也显著高于野生型菌株。原文摘要未提供抑菌圈直径或最小抑菌浓度（MIC）等具体数值，但明确指出“elevated antimicrobial activity”——抗菌活性的提升是编辑效果在表型层面的直接体现。
原文摘要未提供具体数据：plnA、plnE、plnF的具体上调倍数（如qPCR的ΔΔCt值或RNA-seq的FPKM变化）、抗菌活性测定的具体数值（抑菌圈直径、OD₆₀₀等）均未在摘要中给出。
讨论与展望
这项研究的价值在于把“理论上可行”变成了“操作上可实现”。双质粒系统将Cas9表达和供体模板分开，避免了大质粒构建的困难；电转化条件的系统优化——甘氨酸削弱细胞壁、高渗蔗糖保护细胞膜、MMRS复苏——针对性解决了乳酸菌转化效率低的痛点；编辑后抗生素敏感性筛选则巧妙地同时确认了质粒清除。
一个值得注意的设计细节：CRM等位基因同时丢失了spacer识别序列和PAM基序。这意味着即使编辑后残留的Cas9继续表达，也无法再切割已编辑的等位基因。这种“自毁靶位”策略有效避免了Cas9持续切割导致的细胞毒性，可能是编辑成功的关键因素之一。
不过，本研究也留下一些待解问题。plnD敲除后plnA、plnE、plnF上调的具体倍数是多少？抗菌活性增强的幅度有多大？这些定量数据在摘要中未提供。此外，编辑过程中是否观察到脱靶效应，也未见明确说明。后续研究若能补充全基因组测序数据，将更全面地评估该编辑平台的特异性。
从应用角度看，这套双质粒CRISPR/Cas9平台不仅适用于plnD，理论上也可用于植物乳杆菌其他基因的靶向编辑。如果能在更多菌株和更多靶基因上验证其通用性，它有望成为乳酸菌合成生物学研究的标准化工具。
参考来源
Anand R, Lütticken R, De Laporte L, Herrmann A, Heine E. An optimized CRISPR/Cas9-based genome editing platform enhances bacteriocin production in Lactiplantibacillus plantarum. Journal of Biological Engineering. PMID: 42527938.
PMID: 42527938