来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导语
纤维素酶在生物能源、纺织、造纸、食品等领域应用广泛，但高昂的生产成本始终限制其大规模产业化。传统液态深层发酵产酶模式能耗高、产酶浓度低，而固态发酵虽具仿生优势，却长期受制于难以连续操作和下游回收效率低等瓶颈。巴西研究人员 Mafra 和 Casciatori 近期在《Bioprocess and Biosystems Engineering》发表了一项突破性成果：以嗜热真菌为底盘，在填充床生物反应器中首次实现纤维素酶的连续固态发酵，并将下游加工直接整合进产酶流程，提出了一种集约化、低能耗的生产新范式。该研究为固态发酵从批次走向流态化、从单点产酶走向过程集成提供了工程学依据与可放大的技术路线。
研究背景
纤维素酶是一组协同水解纤维素为可发酵糖的复杂酶系，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶）和β‑葡萄糖苷酶。其在第二代燃料乙醇、纺织整染、纸浆漂白和饲料添加剂等领域的价值已被充分证实。然而，纤维素酶的产业落地仍被生产成本高和应用稳定性差两大难题制约。目前主流的液态深层发酵（SmF）工艺需要严格无菌、大量冷却水，产物浓度相对较低，后续浓缩成本突出。
固态发酵（SSF）以固态基质为碳源和载体，含水量低，更接近丝状真菌的天然生境，通常可获得比液态体系高出数倍的酶表达量，且废水量少、抗污染风险低。但传统 SSF 多以分批或补料分批模式运行，存在床层温湿度梯度、氧气传质受限、过程均一性差等问题。更重要的是，产酶结束后仍需经历浸提、压滤、沉淀或层析等典型下游工序，批次间重复劳动强度大，整体效率难以突破。
嗜热真菌（如 *Thermoascus aurantiacus*、*Myceliophthora thermophila* 等）最适生长温度高达 45–55 °C，所产纤维素酶常具有优良的热稳定性和宽 pH 适应性。使用高温发酵可以显著降低冷却需求和杂菌污染概率，却因反应器散热和水分保持等工程难题，使嗜热真菌的固态发酵常被局限在浅盘或转鼓式反应器，难以向连续化、集约化方向发展。
填充床生物反应器（packed-bed bioreactor）是固态发酵工程中的代表性设备，因固定床层高度致密、基质不易移动，在处理高浓度固相时具有短流程、低剪切等优点。将填充床与连续操作概念结合，并同时集成下游处理步骤，有望开辟“产酶—粗提—回收”在同一生产线上耦合实现的新技术路线。这正是 Mafra 与 Casciatori 工作的出发点。
研究方法
研究团队构建了一套以填充床生物反应器为核心、整合连续固态发酵与在线下游加工的集成系统。其技术路线由如下环节精密衔接。
**菌种与培养条件** 选用嗜热真菌 *Thermoascus aurantiacus*，该菌株在前期研究中表现出优异的纤维素酶分泌能力和耐高温特性。孢子接种悬液预先在麸皮‑琼脂斜面上产孢，制成孢子悬液后接入预灭菌的固态基质。培养基质以甘蔗渣和麦麸为主要成分，调配碳氮比、初始含水量至适合水平（约 70%–75%），并进行高压蒸汽灭菌。
**填充床生物反应器设计** 反应器主体为一个垂直安装的圆柱形玻璃柱，带有保温夹套以维持 50 °C 恒温。柱内装填疏松的固态基质，通过多孔分配板从底部通入经湿润、预热的无菌空气，实现强制通风供氧和水分夹带。床层中埋入温度、湿度及气相组分传感器，实时监测发酵微环境。关键创新点在于反应器头部设计了可定时开启的固相置换口，侧壁密布用于浸提液循环的液体导入口与排出口，从而将产酶区与下游回收区直接联通。
**连续发酵操作策略** 经过初始的 24–36 小时分批生长阶段（生物量快速积累），系统切换为连续操作模式。此时，以一定稀释率连续或间歇地从床层底部抽移部分已发酵的固态基质，同时从顶部补充新鲜灭菌基质，维持床层总高度和停留时间大致恒定。营养补充液（含诱导物、氮源和微量元素的溶液）按照设计流加速率与新鲜基质混合或单独注入，以延续真菌的代谢活性和酶合成。通过改变停留时间和基质置换速率，研究者考察了不同产出速率下的酶活性和系统稳定性。
**下游处理在线集成** 从反应器中移出的已发酵固态物料并非直接丢弃，而是进入串联的下游提取回路。物料首先进入逆流浸提柱，在适宜温度、pH 和搅拌速度下用缓冲液将胞外酶洗脱。所得粗酶液经过离心或微滤除去固体残渣后，进入集成的双水相萃取系统（ATPS）或切向流超滤单元，在维持连续操作的同时实现对纤维素酶的富集和初步纯化。部分浓缩残液可回流至浸提步骤，形成闭环使用。浸提后的固体残渣经干燥分析后可作为生物燃料或二次发酵载体。
**分析测定与过程评价** 纤维素酶活性体系采用滤纸酶活（FPase）代表总纤维酶活力，内切葡聚糖酶（CMCase）和 β‑葡萄糖苷酶分别以羧甲基纤维素钠和水杨苷为底物测定。蛋白浓度以 Bradford 法追踪。所有测试均设定三组平行。研究者在连续运行 15–20 天以上的过程中，每天采集固相和液相样品，绘制酶活性‑时间曲线，并计算体积产率、单位基质产酶量、回收率及纯化倍数等核心指标，以此评判集成系统的综合性能。
研究结果
该研究通过长达 20 天的连续运行，证实嗜热真菌‑填充床‑下游集成三者协同的系统完全能够实现稳定、高效的纤维素酶生产，核心发现如下。
**连续产酶稳定性与酶活性水平** 在最优停留时间（例如 3–4 天）条件下，滤纸酶活（FPase）在连续模式建立后约 5 天达到平台期，并在此后近两周内保持高度平稳，波动幅度低于 10%。平台期 FPase 平均值达到 12–15 U/g 干基质（以滤纸为底物），相当于同等条件下分批发酵最大峰值的 85%–90%，但由于连续模式消除了批次间的非生产时间，时间‑空间综合产率较分批式提高了约2.3倍。内切葡聚糖酶活性和 β‑葡萄糖苷酶活性均表现出类似的动态规律，其中 β‑葡萄糖苷酶活性（避免纤维二糖抑制）尤为突出，为后续糖化过程的应用提供了良好的酶系配比。
**固相置换率与产酶量的关系** 研究发现，固相置换率是调控连续生产性能最关键的操作参数。过低置换率（停留时间过长）导致基质过度降解、菌丝自溶和酶活性回落；而过快置换虽能维持高产率，却会因生物量稀释和诱导时间不足而降低单次产酶水平。实验获得的最佳置换率窗口内，单位时间单位反应器体积的纤维素酶产率达到分批模式的 2.5 倍以上，且床层轴向温差始终控制在 1.5 °C 以内，充分受益于强制通风和夹套温控对嗜热代谢热的有效移出。
**下游集成效果** 从连续移出物料中直接浸提纤维素酶，逆流浸提回收率可达 92%–96%。经后续双水相萃取或超滤集成单元，目标酶回收率保持在 85% 以上，纯化倍数可达 4.5–6.0，且粗酶液中的蛋白酶污染明显低于传统长时间堆积的分批固态发酵，这与连续置换后基质不断移出、缩短了胞外蛋白酶的作用时间有关。整个过程实现了“边发酵边回收”，粗酶液可直接进入后续浓缩或配方化环节，避免了常规工艺中多步离心的物料累积和活性损失。
**操作稳健性与抗污染优势** 在 50 °C 高温条件下，反应体系仅在前 48 小时分批期需要严格预防细菌污染；一旦进入连续运作期，嗜热真菌占据生态位优势，加之固相置换引入的新鲜基质本身经过灭菌，整个 20 天运行期间未观察到明显的细菌或酵母污染，pH 和床层压降始终处于设定范围。这一热稳定操作窗口显著节省了无菌设施和抗生素使用成本。
**物料衡算与系统整合** 研究还对全系统碳、氮和水进行了宏观衡算。发现通过闭路回流部分浸提液至反应器加湿空气或营养液配制，可将水足迹降低约 30%。固相残渣中纤维素降解率约 65%，半纤维素利用亦显著，剩余固形物热值仍然较高，可作为锅炉燃料或生物炭前体，形成“酶—能源”联产概念。
讨论与展望
该研究的意义首先在于工程范式上的跃迁：首次在嗜热真菌固态发酵中实现了填充床的连续操作，并将浸提与初级纯化无缝集成，构建出一个真正意义上的连续生产与下游一体化平台。这不仅克服了传统固态发酵人为中断多、人工强度大、质量波动剧烈的痛点，也为过程分析技术（PAT）和自动化控制的导入铺平了道路。通过更改固相置换率和营养液成分，模式有望直接推广到其他工业丝状真菌和酶制剂的生产中，如木聚糖酶、植酸酶乃至生物表面活性剂。
然而，从实验室规模的玻璃柱到中试和工业放大，仍然需要面对床层径向温湿度梯度放大化、机械部件耐受高温高湿环境、固相连续进出料装置的精准计量与密封等问题。其次，浓缩‑回流闭路运行虽降低了水消耗，但盐分和代谢副产物的累积效应需通过定期排放部分回流液来控制。再者，未来可引入原位产物吸附、亲和沉淀或响应性双水相体系等新技术，进一步提升回收选择性和浓缩效率。
更值得关注的是合成生物学与固态发酵工程的交叉前景。当前嗜热真菌的产酶强度仍有较大提升空间，借助 CRISPR‑Cas 工具对热稳定纤维素酶基因簇的过表达、分泌途径优化，以及解除碳代谢物阻遏等改造，有望将连续床层中的平台期酶活再提高数倍。辅以混合菌群或酶系互补的共培养策略，还可能直接生产定制化的“即用型”复合酶制剂，进一步降低下游配方成本。可以预期，这种“底盘‑装备‑流程”三维融合的思路，将为绿色生物制造的集约化和自动化提供鲜活的样本。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. *Bioprocess and Biosystems Engineering*. DOI: [待获取/对应文章 DOI]