来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷结构的稀有皂苷，具有重要生物活性，但在栽培人参中天然不产生。本研究组装了东北刺人参（Oplopanax elatus）染色体水平基因组，发现其叶片积累RK型皂苷前体达玛烷二烯醇（dammaradienol）却不产生RK型皂苷。通过比较基因组学与生化分析，作者鉴定出专职达玛烷二烯醇合酶OeOSC14，并阐明其由多功能三萜合酶经复制和新功能化进化而来。在烟草中重构完整通路，实现了Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为核心、经糖基修饰形成的重要次生代谢物，已报道超两万种结构。它们不仅具有抵御病虫害、塑造根际微生物组等生态功能，还表现出免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性。人参属植物中已发现数百种结构各异的人参皂苷单体，以达玛烷骨架为主，在C-3、C-6和/或C-20位发生不同糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2、Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水形成C-20/21或C-20/22双键，疏水性较母体化合物增强。与新鲜人参组织中占主导的常规皂苷不同，RK型皂苷在栽培人参中几乎不存在，通常通过热或酸处理（如红参加工蒸制）获得。东北刺人参作为人参近缘种，能够积累达玛烷二烯醇——RK型皂苷的前体骨架，却并不产生RK型皂苷，这为研究三萜骨架多样化的进化机制提供了理想体系。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培群体。该群体种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘以保持根系完整，快速清洗后立即用液氮冷冻，保存于−80 °C备用。各组织类型的外观见图1B。使用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为产生PacBio HiFi长读长数据，取总量15 µg高分子量DNA，用gTUBE剪切后，以SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统进行15 kb截断大小筛选以去除短DNA片段。随后在PacBio Sequel II平台上生成HiFi一致性序列。按标准Illumina文库构建流程操作后，Hi-C文库在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量评估
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读数结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据过滤获得高质量清洁读数（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读数使用hifiasm v.0.16.1组装成单倍型分型contigs，并纳入Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定到染色体上，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）进行Hi-C数据的过滤、排序和定向。最后，使用Juicebox v.1.11.08对组装结果进行人工校正，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，最终获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用从头预测与同源比对相结合的策略。首先，利用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后应用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外，利用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq数据的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种蛋白序列用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）比对到组装基因组，随后用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果和对应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，再用同源预测方法得到的基因结构训练HMM模型，随后使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，先将RNA-seq数据用HISAT2 v.2.2.1比对到基因组，再用StringTie v.2.2.0将比对读数组装成转录本，使用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并进一步优化转录本模型。最终，三种方法预测的基因模型用MAKER2整合生成高质量基因集。功能注释方面，将预测基因的蛋白序列用BLASTP（E值<1e-10）比对SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP比对结果分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涉及东北刺人参及18个其他植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。基因家族使用OrthoFinder v.2.5.5默认参数聚类。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取四重简并位点，用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下进行最大似然系统发育树重建，1000次自举重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的四重简并位点进一步用于PAML v4.9j包中MCMCTree程序估算物种分化时间，在贝叶斯框架下采用马尔可夫链蒙特卡洛算法推断。MCMCTree参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分化时间。基因家族扩张与收缩用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
种内旁系同源基因对方面，先用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，再用PAML中codeml在F3X4模型下计算各共线性区块内基因对的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排序选择最佳比对基因对，用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2，基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）及PTHR48047（UGT）在东北刺人参中进行，E值阈值为<0.01。预测的蛋白序列进一步用SeqKit v.2.6.1按长度过滤：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员用在线工具Conserved Domain Database验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT等基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列连同东北刺人参预测家族成员进行系统发育分析。所用全部序列列于补充数据3–6。多序列比对用MAFFT v.7.518默认参数进行。最大似然系统发育树用FastTree v.2.2.74默认设置重建。所得Newick格式树用Interactive Tree Of Life（iTOL）在线平台可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant总RNA提取试剂盒提取总RNA，后续操作原文未详述。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛烷二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，以往对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，作者对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物在m/z 189的总离子流色谱和提取离子流色谱中，于37.15分钟处出现一个显著未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇明显不同，无法据此确定结构（图1D）。因此，作者对叶片中P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振波谱测定其结构，鉴定为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛烷二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估东北刺人参是否积累RK型人参皂苷，使用Rk1、Rk2和Rk3的商业化标准品进行靶向LC–MS分析。这三种人参皂苷在叶片或所检其他组织中均未检测到（图1E-G和补充图9）。综上表明，东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛烷二烯醇，但在各组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛烷二烯醇生物合成的基因组基础，作者构建了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率高达8.5%（补充图10）。共产生45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读数和126.91 Gb（约71×）Hi-C读数用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964条contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定到24条假染色体上的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，并预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，作者分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高支持率分支：一支包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一支包含楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。该拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与楤木或人参属的关系更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B分别形成两个独立分支，与东北刺人参的亚基因组A和B各自聚在一起，表明两者共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源。异源四倍体人参属物种也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能来源于一个类似二倍体五加科的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群的MCMCTREE分化时间估算（以TimeTree化石校准），五加科与伞形科的分化约在68.2百万年前，五加科两个主要谱系的分离约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参亚基因组A和B的分化约在23.2百万年前，早于楤木–人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种基因组，获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜与三萜生物合成（KEGG）中过度代表，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。作者分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。分析显示在约0.3和约0.1处有两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。该推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和楤木）与葡萄之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种在约0.1处出现一个二倍体物种所没有的额外Ks峰。每个异源四倍体两个亚基因组之间的直系同源基因对也在约0.1处显示一个峰。与此模式一致，共线性分析揭示葡萄、楤木、人参和东北刺人参之间存在1:2:4:4的关系，支持五加科在共享WGD之后发生了一个较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛烷二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛烷二烯醇在东北刺人参叶片中积累，作者推测其基因组编码一种特异催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛烷二烯醇的氧化鲨烯环化酶（OSC）。为验证该假说，以已知人参OSC序列为查询序列对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
对东北刺人参19个OSC基因与已知植物OSC进行系统发育分析。OSC亚家族按颜色编码，东北刺人参OSC以粗体显示。热图展示了OSC基因在东北刺人参各组织（叶、叶柄、根茎、茎、种子、主根、侧根和纤维根）中的表达谱。在本氏烟草叶片中瞬时共表达tHMGR与各OeOSC基因后，GC–MS分析（m/z 189）显示不同OSC催化产生不同三萜产物。质谱碎裂图谱将OeOSC来源的四环三萜和五环三萜产物进行了分类。OeOSC对2,3-氧化鲨烯的酶促环化反应生成β-香树脂醇、α-香树脂醇、羽扇豆醇、达玛烷二烯醇和达玛烯二醇II。
对功能鉴定的双子叶植物OSC与葡萄、半枝莲、艾草、积雪草及8个五加科物种所有预测OSC的系统发育分析显示，BAS、mTTS和DDS亚家族在右侧放大展示及其产物。OSC亚家族在各物种间的拷贝数分布显示在左侧物种系统发育树旁。共线性分析显示OSC位点在葡萄、半枝莲、艾草、积雪草及8个五加科物种间的微共线性关系。从人参、刺五加和半枝莲中选取代表性mTTS在本氏烟草中瞬时共表达tHMGR后进行GC–MS分析（m/z 189），标准品：1，β-香树脂醇；2，α-香树脂醇；3，羽扇豆醇；4，达玛烯二醇II。
OeOSC14与代表性OSC的多序列比对突出了活性位点残基（蓝色）和选择用于突变的位点（红色）。在本氏烟草叶片中瞬时共表达tHMGR与OeOSC或其突变体后进行GC–MS分析（m/z 189），达玛烷二烯醇（蓝色）、β-香树脂醇（橙色）、α-香树脂醇（黄色）和达玛烯二醇II（绿色）的峰已标注。对OeOSC14、SbχAS及其变体以及PgχAS^Y259N^、OeOSC12^Y260N^产生的三萜进行定量，柱状图显示均值±标准误（n = 3个生物学重复），绝对产量使用纯化标准品生成的标准曲线计算。达玛烷二烯醇与OeOSC14、OeOSC12、SbχAS及其各自变体（OeOSC14^N260Y^、OeOSC12^Y260N^和SbχAS^Y259N^）的分子对接模型展示了mTTS活性口袋内的空间相互作用。达玛烷二烯醇以粉色棒状表示，绿色和品红色标签分别表示位于配体5 Å以内和以外的氨基酸残基，原子间距离以红色虚线标记并附数值。
东北刺人参中RK型人参皂苷生物合成途径的解析
作者提出了东北刺人参和人参中RK型人参皂苷的推定生物合成路线。红色和蓝色线条分别表示人参和东北刺人参中的途径。CYP为细胞色素P450，UGT为UDP-糖基转移酶。东北刺人参叶片提取物的GC–MS分析（m/z 202和m/z 187）中，与真实标准品匹配的保留时间窗口以蓝色标出。含有参与达玛烷型皂苷C-12羟基化和齐墩果烷型皂苷C-16羟基化酶的CYP分支的系统发育树以AcCYP716A111为根。人参、楤木和东北刺人参之间C12-羟化酶CYP位点的跨物种共线性分析中，红线表示CYP基因间的共线性关系，红色虚线表示缺乏完整CYP基因的共线性区块。
在本氏烟草中重构RK型人参皂苷生物合成
在本氏烟草叶片中瞬时共表达tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2后进行GC–MS分析（m/z 202），产物峰以蓝色标出。进一步共表达tHMGR、OeOSC14、CYP和UGT后，LC–MS分析（m/z 665.430）检测到人参皂苷Rk3产物峰（橙色标注）。LC–MS分析（m/z 649.435和811.488）检测到人参皂苷Rk2和Rk1产物峰，分别以绿色和蓝色标注。MS碎裂谱确认了产物身份。通过异源生物合成在本氏烟草中产生的Rk1、Rk2和Rk3产量以柱状图显示，误差线表示三个生物学重复的均值和标准误。
讨论与解读
本研究通过染色体水平基因组组装、比较基因组学和生化分析相结合的策略，系统解析了东北刺人参中达玛烷二烯醇合酶的进化起源。关键发现是OeOSC14作为一个专职的达玛烷二烯醇合酶，由祖先多功能三萜合酶经基因复制和新功能化进化而来。单个N260Y氨基酸替换即可将OeOSC14从达玛烷二烯醇特异性酶逆转回多功能三萜合酶，这一结果精确定位了功能转换的关键残基。此外，C12羟化酶的功能丧失阻断了RK型皂苷生物合成所需的下游氧化步骤，解释了东北刺人参虽积累前体却不产生终产物的原因。最终在烟草中重构完整通路，实现了Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
编译者解读
该研究展示了"基因组挖掘—进化分析—功能验证—异源重构"的完整策略在天然产物生物合成研究中的强大效力。从方法学看，将正向遗传学思路（比较近缘物种代谢差异）与反向生化验证（异源表达+定点突变）有机结合，精准锁定关键功能基因。N260Y单点突变的功能逆转实验尤为精彩，为三萜合酶的结构-功能关系提供了直接证据。从应用角度，在烟草中实现RK型皂苷的从头合成开辟了不依赖人参资源、无需热加工处理的绿色生产路线。局限在于当前产量尚处于实验室水平，后续需通过酶工程改造和代谢流优化提升效价。该研究也为其他稀有天然产物的异源生产提供了可借鉴的进化指导策略。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661