来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，启发科学家构建多酶级联体系生产复杂分子。然而，酶不相容性、底物传递差和催化剂回收难长期制约实际应用。本研究报道了一种在Pickering乳液中运行的活体生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自发组装于水油界面稳定乳液。该平台将化学酶催化和多酶级联反应速率提升至传统双相体系的45倍，并实现了按需双模式回收。
研究背景
生物体内的酶级联系统堪称化学制造的巅峰，能将简单前体转化为复杂高值分子，其精妙之处在于将多种酶组织在特定细胞微环境中，克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等难题。将这一概念转化到工业规模合成，有望在温和水相条件下实现原子经济性路线，推动更可持续的化学工业发展。全细胞生物催化利用工程微生物作为自我维持、自我复制的微型工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并原位提供必要辅因子，是颇具吸引力的策略。
但全细胞生物催化的大规模应用，尤其涉及疏水底物或产物的多步级联反应，仍面临显著障碍。首要挑战是水相细胞环境与不混溶有机相之间跨相界的传质不良，导致反应速率低下。此外，许多级联反应需要生物催化剂与化学催化剂协同（化学酶反应），而两者往往在互不相容的条件下运行；有机溶剂的直接接触还会损害细胞活力。本研究报道的活体生物催化平台，通过可调超分子化学在过表达酶的E. coli表面接枝油基光催化剂，生成两亲性“超细菌”，在Pickering乳液中自组装于水油界面，实现界面生物催化。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后，通过注射加入2-(甲基氨基)乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤，直至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-(二甲氨基)吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。过滤产物，旋转蒸发除去溶剂后，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯:石油醚 = 1:3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
氨基化CD（ACD）的合成
首先，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，在冰浴中冷却至5 °C以下。随后，在剧烈搅拌下于5分钟内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C持续搅拌下维持30分钟，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1小时。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
其次，将4,7,10-三氧杂-1,13-十三碳二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，然后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集形成的沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈:H₂O:氨水 = 1:1:0.2）。最后，纯化产物在50 °C真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即氨基化CD（ACD）。
偶联物（cell@OBC）的制备
ⅰ）偶联物（cell@CD）的制备
将新鲜收集的E. coli分散在40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入E. coli分散液中，在4 °C反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，除去过量的游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，最终偶联物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0，备用。
ⅱ）偶联物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散在40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液，在4 °C反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，除去过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同E. coli的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。然后，在乳液中加入100 mM底物启动反应。每隔一定时间，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，再用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测定。所有实验均设三次重复。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从关键组件的模块化合成开始：氨基化β-环糊精（ACD）主体和定制OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4、5）。在此基础上，研究团队对活体E. coli BL21 (DE3)细胞表面进行工程化改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，生成cell@CD偶联物（补充图6）。其次，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。UV-Vis光谱证实了OBC的成功非共价连接——cell@OBC在330 nm处显示蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞与游离OBC的对照混合物中无此峰（补充图7），为主客体超分子连接提供了明确证据。关键的是，蒽醌单元的光催化活性未因其结合入OBC结构而受阻（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD偶联物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）浓度，可精确控制细胞表面β-CD密度，荧光强度的相应增加证实了这一点（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD偶联物周围有清晰的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞无此现象，确认了β-CD主体的成功共价连接（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，ζ-电位表征显示表面电荷随超分子负载量增加从天然细胞的−45 mV逐渐变化至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可精确调控，以适应多样化功能需求。
然而，功能化程度与胞内酶活性保留之间呈反比关系。研究使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的E. coli评估对胞内酶功能的影响，发现过度表面功能化虽增加疏水性，却显著降低酶活性保留率（图2f）。这一下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，既赋予稳健的乳化性能，又保留超过97%的胞内酶活性。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外传质屏障，研究裂解cell@OBC释放游离BAL酶，将其活性与cell@OBC和天然细胞比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了研究假设。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的关键优势在于细胞为酶提供的保护环境。研究假设表面修饰能进一步保护细胞免受工艺中常见的严苛条件影响。为此，研究将cell@OBC偶联物置于热和化学应激条件下测试。在45 °C暴露两小时后，cell@OBC保留69.6%的初始胞内BAL活性，是未修饰天然细胞的2.4倍（图3a）。更引人注目的是，在甲苯-水界面——一种以诱导细胞裂解著称的条件——cell@OBC偶联物在两小时后维持52.2%的活性，而天然细胞活性显著下降，稳定性提升2.8倍（图3b）。研究还测试了N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲亚砜（DMSO）等其他溶剂，进一步巩固聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经2小时紫外线照射后，cell@OBC的活性保留率仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。活/死染色实验证实了这些发现，直观展示了cell@OBC偶联物在热和有机溶剂应激下相比天然细胞的优越存活率（图3d-i）。
讨论与解读
本研究通过可调超分子表面化学策略，成功将活细胞转化为两亲性“超细菌”，在Pickering乳液中构建了高效界面生物催化平台。该平台的核心创新在于利用环糊精主客体化学实现油基光催化剂在细胞表面的可逆接枝，既赋予细胞界面稳定能力，又保留了胞内酶活性（>97%）。系统优化表明，18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件是平衡表面功能化与酶活性的关键节点。细胞@OBC在热、溶剂和紫外应激下均表现出显著增强的稳定性，活性保留率提升2.1-2.8倍。
界面催化实验显示，该平台支持单步、顺序和一步级联反应，反应速率较传统双相体系提升高达45倍，并可实现克级苯偶姻合成。更重要的是，动态超分子连接使催化剂可按需双模式回收——活细胞偶联物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞上。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，这项工作的价值在于巧妙解决了全细胞催化中长期存在的三大痛点：疏水底物传质差、化学催化剂与生物催化剂不相容、催化剂回收困难。利用超分子主客体化学实现催化剂的非共价表面修饰，既避免了共价修饰对细胞膜的不可逆损伤，又赋予了按需拆解回收的灵活性。45倍的反应速率提升和克级产物合成展示了工业放大潜力。值得关注的是，该平台的可扩展性——通过过表达不同酶（ATA、RR ADH、BAL、Cal B等）即可拓展至多种级联反应，体现了“即插即用”的平台化思维。局限在于当前仍以模式菌株E. coli为主，向工业菌株和更复杂底物的拓展有待验证；超分子连接的长期稳定性也需在实际连续流工艺中检验。
参考来源
Wu X, Dimde M, Karring H, Wang Z, Wu C. Assembly-Line Biosynthesis in Living-Cell Emulsions via Tunable Supramolecular Surface Chemistry. Nat Commun. PMID: 42342679.
PMID: 42342679