来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
导读
维生素A是人体必需微量营养素，传统化学合成法环境负担沉重。本研究首次在产油酵母Lipomyces starkeyi中构建维生素A生物合成通路，通过引入β-胡萝卜素合成酶与β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶，结合甲羟戊酸通路强化与两相发酵策略，在3-L补料分批发酵中实现超过600 mg/L的维生素A产量，其中90%以上分泌至胞外。该工作为可持续维生素A生产提供了新平台。
研究背景
维生素A对视觉、免疫功能和细胞分化至关重要。传统生产以化学合成为主，环境挑战显著。微生物发酵虽为可持续替代方案，但产量与成本效益尚不及化学合成。产油酵母如Lipomyces starkeyi能合成高水平乙酰辅酶A和脂质，是生产维生素A等高价值亲脂性化合物的潜力平台。本研究首次将L. starkeyi改造为维生素A生产菌株，系统整合β-胡萝卜素与类视黄醇合成通路，并优化甲羟戊酸通路与前体供给。
研究方法
菌株与培养基
本研究所用酵母菌株列于表1。L. starkeyi ∆lslig4（同源重组效率增强菌株）用于构建维生素A生产菌株，该菌株源自L. starkeyi CBS1807。酿酒酵母改造使用亲本菌株YPH499（Stratagene，美国加州）。L. starkeyi和酿酒酵母菌株均在30°C的YPD培养基（1% Bacto™酵母提取物（Thermo Fisher Scientific）、2% Bacto™蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）、2%葡萄糖）中培养。固体培养基添加2% Bacto™琼脂（Thermo Fisher Scientific），视需要添加100 μg/mL Geneticin™（Thermo Fisher Scientific）、100 μg/mL潮霉素B（FUJIFILM Wako Pure Chemical，日本）、30 μg/mL诺尔丝菌素（FUJIFILM Wako Pure Chemical）和/或50 μg/mL Zeocin™（Invitrogen Corporation，美国加州）。酿酒酵母菌株在30°C的SD合成限定培养基中培养，配方为0.17%酵母氮碱（不含氨基酸和硫酸铵，Thermo Fisher Scientific）、0.5%硫酸铵（Nacalai Tesque，日本）、2%葡萄糖、0.14%酵母合成 dropout 补充物（不含尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸，Sigma-Aldrich，美国密苏里州）。需要时添加尿嘧啶（100 μg/mL）、亮氨酸（30 μg/mL）、色氨酸（80 μg/mL）和组氨酸（100 μg/mL）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）。固体培养基添加2% Bacto™琼脂。
表1 本研究所用酵母菌株
Lipomyces starkeyi菌株：
| 菌株名 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |
|--------|----------|------|------|
| Δlslig4 | CBS1807 | Δlslig4::PTDH3-Sh ble-TTDH3 | Oguro et al. |
| KHNU-1 | Δlslig4 | Δlslig4::P70486-McCarRP-T70486-PTDH3-McCarB-TTDH3-PACT1-KanR-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-2 | KHNU-1 | KHNU-1, Δlstgl3::PTDH3-XdCrtE-TTDH3-PACT1-hph-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-3 | KHNU-2 | KHNU-2, 18S rDNA::PACT1-sNAT1-TACT1-P70486-MbBlh-T70486 | 本研究 |
| KHNU-4 | KHNU-2 | KHNU-2, Δlsku80::P70486-MbBlh-T70486-PTDH3-MbBlh-TTDH3-PACT1-sNAT1-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-5 | KHNU-3 | KHNU-3, Δlstgl4::PTDH3-HMG1-TTDH3-PACT1-Sh ble-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-6 | KHNU-3 | KHNU-3, Δlstgl4::PTDH3-tHMG1-TTDH3-PACT1-Sh ble-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-7 | KHNU-3 | KHNU-3, Δlsku80::PTDH3-tHMG1-TTDH3-P70486-ERG10-T70486-PTDH3-ERG13-TTDH3-PACT1-Sh ble-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-8 | KHNU-2 | KHNU-2, 18S rDNA::P70486-CrCrtW-T70486-PACT1-sNAT1-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-9 | KHNU-2 | KHNU-2, 18S rDNA::P70486-HpCrtZ-T70486-PACT1-sNAT1-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-10 | KHNU-2 | KHNU-2, 18S rDNA::P70486-EuCrtZ-T70486-PACT1-sNAT1-TACT1 | 本研究 |
| KHNU-11 | KHNU-2 | KHNU-2, 18S rDNA::P70486-BrevCrtZ-T70486-P3900-PspCrtW-T3900-PACT1-sNAT1-TACT1 | 本研究 |
酿酒酵母菌株：
| 菌株名 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |
|--------|----------|------|------|
| YPH499 | — | MATa ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 | Stratagene |
| KHNU-S1 | YPH499 | YPH499, Δhmg1::PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1 | 本研究 |
| KHNU-S2 | KHNU-S1 | KHNU-S1, pYES2(LEU2)-CsPDP, pYES2(HIS3)-empty | 本研究 |
| KHNU-S3 | KHNU-S1 | KHNU-S1, pYES2(LEU2)-CsPDP, pYES2(HIS3)-LsGGS1 | 本研究 |
| KHNU-S4 | KHNU-S1 | KHNU-S1, pYES2(LEU2)-CsPDP, pYES2(HIS3)-XdCrtE | 本研究 |
大肠杆菌HST08（Takara Bio，日本）用于基因克隆和质粒扩增，在37°C的LB培养基（1%胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）、0.5% Bacto™酵母提取物、0.5% NaCl）中添加100 mg/L氨苄青霉素筛选。
通用分子生物学技术
聚合酶链式反应（PCR）使用KOD Fx Neo和KOD One DNA聚合酶（TOYOBO，日本），按制造商说明书操作。基因组DNA使用Gen Toru-Kun酵母试剂盒（Takara Bio）提取，质粒DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，德国）提取。限制性内切酶购自Takara Bio。
质粒与菌株构建
质粒和菌株构建所用引物列于表S1。异源基因包括未培养海洋细菌66A03来源的Blh（MbBlh）、M. circinelloides来源的CarRP和CarB（McCarRP和McCarB）、Xanthophyllomyces dendrorhous来源的CrtE（XdCrtE），均针对L. starkeyi表达进行密码子优化，由Eurofins Genomics（日本）合成（表S2）。XdCrtE和Croton stellatopilosus来源的CsPDP基因（均针对酿酒酵母密码子优化）由Eurofins Genomics合成（表S2）。
为构建酿酒酵母菌株KHNU-S1，组装基因组整合盒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1，步骤如下：首先，从酿酒酵母YPH499基因组DNA扩增HMG1的5′和3′非翻译区（UTR），引物对分别为ScHMG1_us_F/cHMG1_us_R和ScHMG1_ds_F/ScHMG1_ds_R。载体骨架用pBlue_F1/pBlue_R1引物从pBluescript II KS(+)扩增。这些DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix（Takara Bio）连接，生成pBlue-HMG1us-HMG1ds。接着，用PGK1p_F/PGK1p_R和PGK1t_F/PGK1t_R引物对从YPH499基因组DNA扩增PGK1启动子和终止子。KanR基因用G418r_F1/G418r_R1引物从质粒pGKNEO2扩增。载体骨架用pBlue_F2/pBlue_R2引物从pBluescript II KS(+)扩增。所得DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix连接，构建pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66。最后，用pBlue_HMG1_vec_F/pBlue_HMG1_vec_R引物从pBlue-HMG1us-HMG1ds扩增载体骨架，用G418r_F2/G418r_R2引物从pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66扩增KanR表达盒，用ScHMG1_F/ScHMG1_R引物从pARS308-ERG12-tHMG1-URA扩增tHMG1表达盒。这些DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得最终质粒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1。
为构建酿酒酵母表达质粒pYES2(LEU2)-CsPDP、pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，先将亲本载体pYES2/CT中的标记基因URA3替换为LEU2或HIS3，分别生成pYES2(LEU2)-empty或pYES2(HIS3)-empty。LEU2和HIS3 DNA片段分别用LEU2_F/LEU2_R和HIS3_F/HIS3_R引物对从酿酒酵母基因组DNA扩增。所得PCR产物与用pYES2CT_F/pYES2CT_R引物扩增的pYES2/CT骨架片段通过In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(LEU2)-empty和pYES2(HIS3)-empty。
为构建pYES2(LEU2)-CsPDP，用CsPDP_Sc opt_F/CsPDP_Sc opt_R引物扩增针对酿酒酵母密码子优化的CsPDP基因（Eurofins Genomics合成），与用pYESCT_F2/pYESCT_R2引物扩增的pYES2(LEU2)-empty骨架通过In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装。为构建pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，分别用LsGGS1_Sc opt_F/LsGGS1_Sc opt_R引物从L. starkeyi扩增LsGGS1 cDNA，用XdCrtE_Sc opt_F/XdCrtE_Sc opt_R引物扩增针对酿酒酵母密码子优化的XdCrtE基因（Eurofins Genomics合成）。各扩增基因片段与用引物pYESCT_F2/pYESCT_R2扩增的pYES2(HIS3)-empty骨架通过In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE。
酿酒酵母菌株KHNU-S1通过将质粒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1经XhoI酶切纯化后转化细胞构建。KHNU-S2通过将pYES2(LEU2)-CsPDP和pYES2(HIS3)-empty载体导入KHNU-S1生成。同样，KHNU-S3和KHNU-S4分别通过将pYES2(LEU2)-CsPDP与pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE共转化KHNU-S1获得。
为构建L. starkeyi菌株KHNU-1和KHNU-2的β-胡萝卜素生产质粒，开发了表达盒pKS/lig4/McCarRP-McCarB和pKS/tgl3/XdCrtE。对于pKS/lig4/McCarRP-McCarB，从L. starkeyi基因组DNA扩增以下DNA片段：LsLIG4的5′和3′ UTR（引物：lig4_us_F/lig4_us_R和lig4_ds_F/lig4_ds_R）、70486启动子和终止子（原文未详述完整引物序列）。
图1展示了L. starkeyi中维生素A生物合成代谢通路工程的整体设计。该代谢网络将MVA通路（粉色）、β-胡萝卜素合成（黄色）、维生素A（类视黄醇）合成（橙色）与TAG代谢（蓝色合成、紫色降解）相连接。MVA通路产生萜类前体DMAPP和IPP，缩合为GPP、FPP和GGPP。β-胡萝卜素通路经Mucor circinelloides来源的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（McCarRP）和八氢番茄红素脱饱和酶（McCarB）将GGPP转化为β-胡萝卜素。来自Xanthophyllomyces dendrorhous的异源GGPP合酶（XdCrtE）增强FPP到GGPP的通量。维生素A通路经海洋细菌66A03来源的β-胡萝卜素双加氧酶（MbBlh）将β-胡萝卜素转化为视黄醛，再经内源视黄醛还原酶（ENV9）或其他视黄醛还原酶还原为视黄醇。异源基因以红色显示，L. starkeyi内源基因以黑色显示。
研究结果
本研究首次将L. starkeyi工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素和类视黄醇生物合成通路的关键酶实现。该方法包括整合编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶（McCarRP）、八氢番茄红素脱饱和酶（McCarB）和β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶（MbBlh）的基因。进一步优化甲羟戊酸通路后，在3-L补料分批发酵中实现超过600 mg/L的维生素A产量。Fe²⁺ supplementation提高了产量，使用十二烷和丁基羟基甲苯的两相培养系统增强了维生素A回收率，90%以上在胞外相中回收。
图2展示了L. starkeyi中β-胡萝卜素和维生素A生物合成通路的构建及MbBlh拷贝数对维生素A产量的影响。图2A比较了L. starkeyi Δlslig4（对照）、KHNU-1和KHNU-2菌株的表型，随着异源β-胡萝卜素基因（McCarB、McCarRP、XdCrtE）的引入，色素沉着逐步加深。图2B为KHNU-1和KHNU-2提取的β-胡萝卜素HPLC色谱图，与标准品对照。图2C评估了72 h时酿酒酵母菌株KHNU-S2（内源BTS1）、KHNU-S3（过表达L. starkeyi GGS1）和KHNU-S4（过表达XdCrtE）的GGPP合酶活性，GGOH经GC/MS定量，插图为GGPP磷酸酶测定示意图。图2D的HPLC色谱图确认了表达海洋细菌66A03来源MbBlh的L. starkeyi KHNU-3（Blh_18S_1）中视黄醛和视黄醇的产生，峰与标准品对照鉴定。图2E显示KHNU-3（Blh_18S_1）在72 h时单相和两相培养下的维生素A产量，使用含1%（w/v）BHT的十二烷（20%，v/v）进行原位萃取，堆叠柱状图分别显示视黄醛（实心柱）和视黄醇（空心柱）。图2F比较了96 h时不同MbBlh拷贝数的KHNU-3（Blh_18S_1–6）和KHNU-4（Blh_KU80）菌株的维生素A滴度，视黄醛（实心柱）和视黄醇（空心柱）分别显示。图2G通过定量PCR分析KHNU-3（Blh_18S_1–6）菌株中MbBlh基因拷贝数。图2H通过qRT-PCR测定48 h后KHNU-3（Blh_18S_1–6）菌株中MbBlh相对转录水平。数据为三次独立实验的均值±SEM；星号表示统计学显著差异（Student's t检验或Dunnett检验；*P < 0.05）。
图3展示了通过强化MVA通路增强L. starkeyi维生素A产量。图3A显示过表达HMG1和截短HMG1（tHMG1）对96 h培养后维生素A产量的影响，以KHNU-3菌株为亲本对照，视黄醛（实心柱）和视黄醇（空心柱）分别显示，β-胡萝卜素以阴影柱表示。图3B显示共过表达tHMG1、ERG10（乙酰辅酶A乙酰转移酶）和ERG13（HMG-CoA合酶）后96 h培养维生素A产量的进一步提升，视黄醛（实心柱）、视黄醇（空心柱）和β-胡萝卜素（阴影柱）分别呈现。图3A和图3B的数据来自相同条件下独立进行的培养实验。数据为三次独立实验的均值±SEM。星号表示显著差异（Dunnett检验；*P < 0.05）。
图4展示了碳源和Fe²⁺ supplementation对L. starkeyi KHNU-7维生素A产量的影响。图4A显示不同碳源对工程菌株L. starkeyi KHNU-7维生素A产量的影响。细胞在含2%（w/v）各指示碳源的YP培养基中，于含20%（v/v）十二烷（含1%（w/v）BHT）的两相培养条件下培养96 h。视黄醛（实心柱）和视黄醇（空心柱）分别显示。图4B显示Fe²⁺ supplementation对96 h维生素A产量的影响。KHNU-7在含不同FeSO₄浓度（0–2.8 mM）的YPD培养基中培养。视黄醛（实心柱）、视黄醇（空心柱）和β-胡萝卜素（阴影柱）分别呈现。数据为三次独立实验的均值±SEM。星号表示统计学显著差异（Dunnett检验；*P < 0.05）。
图5展示了工程菌株L. starkeyi KHNU-7补料分批发酵生产维生素A的时间进程。记录了168 h培养期间细胞生长（OD600）、胞外和胞内维生素A、胞内β-胡萝卜素、葡萄糖浓度和胞内三酰甘油（TAG）的变化曲线。胞外视黄醛和视黄醇以单独的虚线显示，以区分其在发酵过程中的动态变化。数据为三次独立实验的均值±SEM。
讨论与解读
本研究证实L. starkeyi是可持续维生素A生产的潜力宿主。尽管产量已取得显著提升，但通路调控和发酵条件仍需进一步优化方能达到经济竞争力水平。这些发现为将L. starkeyi开发为维生素A及其他高价值萜类的大规模生产平台奠定了基础。
编译者解读
本研究选择了产油酵母L. starkeyi作为底盘，巧妙利用其天然的高乙酰辅酶A和脂质代谢通量来支撑萜类前体供给——这是"以己之长"的典型合成生物学策略。两相培养配合BHT抗氧化剂解决维生素A的稳定性与回收问题，思路务实。但600 mg/L产量距工业化仍有距离，且MbBlh拷贝数试验显示基因剂量与产量并非简单线性关系，提示通路蛋白折叠或辅因子供给存在瓶颈。未来若能在脂滴区室化表达或视黄醇酯化储存方向突破，有望进一步释放该宿主潜力。
PMID: 42121163