来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
导语
CRISPR-Cas9基因编辑技术早已成为生命科学研究的利器，但在酿酒酵母中，向导RNA（sgRNA）的构建却长期依赖限制性内切酶和连接酶的传统克隆流程，操作繁琐且迭代缓慢。2025年发表于《STAR Protocols》的一项研究，提出了一种基于PCR的引导序列插入方案，将传统的酶切-连接步骤替换为PCR扩增和同源重组，配合Cas9质粒的无缝环化，实现了引导序列的快速迭代。该方案借助KanMX/G418筛选标记，使整个编辑流程更加简洁高效。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式真核生物，在基础研究和工业应用中占据重要地位。CRISPR-Cas9系统的引入，让酵母基因组编辑变得精准可控。然而，一个常被忽视的瓶颈在于sgRNA表达质粒的构建——传统方法需要设计并合成互补寡核苷酸，经过磷酸化、退火、限制酶消化、连接转化等多个步骤，才能将引导序列装入载体。这一过程不仅耗时，而且每一步都可能引入失败风险。
更麻烦的是，当研究者需要测试多个不同靶位点的引导序列时，每一轮迭代都要重复上述全套流程。这种“克隆瓶颈”大大拖慢了基因编辑的筛选速度。为突破这一限制，研究人员开发了基于PCR的引导序列安装策略，用PCR扩增产物直接替换传统的酶切-连接步骤，再借助酵母细胞内源的同源重组机制完成质粒环化。该方案同时设计了同源定向修复（HDR）供体模板，实现了编辑与筛选的一体化流程。
研究方法
该协议的核心思路是：将sgRNA引导序列通过PCR扩增引入Cas9质粒，并在大肠杆菌中完成克隆验证，随后将验证过的质粒与HDR供体共同转化酵母，利用LiAc/PEG方法实现高效转化。整个流程分为几个关键环节，每个环节都有明确的试剂配方和操作参数。
培养基配制是整个实验的基础。LB液体培养基（含卡那霉素）的配方为：LB肉汤粉25 g/L，加ddH₂O定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟，冷却至约55°C后加入无菌过滤的卡那霉素储存液（50 mg/mL）至终浓度50 μg/mL。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存长达6个月，含卡那霉素的培养基则应在4°C保存，保质期1个月。LB琼脂平板同样含卡那霉素（50 μg/mL），额外添加Bacto琼脂1.5%（w/v），灭菌后倒板，室温凝固后4°C倒置保存。
酵母培养使用YPD液体培养基：葡萄糖2%（w/v）、蛋白胨2%（w/v）、酵母提取物1%（w/v），121°C灭菌15–20分钟，室温保存6个月。YPD + G418琼脂平板则在基础配方中添加Bacto琼脂2%（w/v），灭菌冷却后加入G418储存液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL。
sgRNA与HDR供体设计是编辑特异性的决定因素。研究者需要针对目标位点设计sgRNA序列，同时构建HDR供体模板。供体设计中包含同源臂以及必要的突变位点——值得注意的是，供体需要包含沉默的PAM破坏突变，防止编辑成功后Cas9再次切割已修复的位点，这一细节体现了设计上的周密考虑。
引导序列插入采用PCR扩增方式生成线性化片段，片段两端带有与Cas9质粒同源的序列。将PCR产物与线性化的Cas9质粒共同转化大肠杆菌，利用大肠杆菌内的同源重组机制实现质粒环化——原文摘要未详述具体的重组酶系或转化条件参数。转化后的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的LB平板，37°C培养过夜。挑取克隆进行菌落PCR和测序验证，确认引导序列正确插入且质粒序列完整。
酵母共转化采用经典的醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）方法。将序列验证正确的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA共同转化酿酒酵母感受态细胞。转化混合物中包含LiAc、PEG以及载体DNA（原文摘要未详述具体浓度和孵育时间），经过热激处理后，涂布于YPD + G418平板。G418（Geneticin）筛选依赖于质粒上携带的KanMX标记基因，只有成功摄入质粒的酵母细胞才能在含G418的平板上生长。
转化后平板置于30°C培养2–3天。实验设计包含一个关键的阴性对照——“无修复供体”（–HDR donor）条件。这一对照的意义在于：Cas9切割靶位点后，如果没有供体模板进行同源修复，DNA双链断裂无法修复将导致细胞死亡。因此，“CRISPR + HDR供体”条件下应长出大量菌落，而“无供体”对照应只有极少菌落甚至无菌落。这种“多对少”的对比，既验证了转化和筛选体系的有效性，也确认了所选引导序列能在目标位点高效切割。
研究结果
该协议最直观的结果呈现于筛选平板上的菌落对比。按照预期，经过LiAc/PEG转化和恢复培养后，YPD + G418平板上的选择压力富集了携带KanMX标记CRISPR质粒的酵母细胞。30°C培养2–3天后，“CRISPR + HDR供体”条件通常产生大量菌落，而“无修复供体”对照则只有少量菌落——因为Cas9切割造成的DNA双链断裂在缺乏修复模板时是致死的。这种“多对少”的鲜明对比，是实验成功与否的初步判断依据。
下游验证环节，研究者通过菌落PCR筛选编辑阳性克隆。具体操作是：挑取6–8个菌落，使用跨越同源臂的引物进行菌落PCR。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物。对于删除或插入类型的编辑，PCR产物相对未编辑对照会出现明显的条带位移；而点突变类型的编辑可能无法通过条带大小区分，需要进一步依赖DNA测序确认。成功的实验中，至少有一部分被筛选的菌落呈PCR阳性，跨越连接区域的DNA测序结果应与设计基因型一致——包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。
编辑完成后的质粒清除是一个常被忽视但实际应用中的重要环节。在非选择性培养基（YPD）中培养后，部分编辑克隆会自发丢失KanMX标记的CRISPR质粒。这一现象可通过影印接种到YPD和YPD + G418平板来评估：已清除质粒的克隆能在YPD上生长，但在G418平板上无法存活。这一步骤为后续需要在无质粒背景下进行实验的研究者提供了质粒清除的验证方案。
讨论与展望
这项协议的核心贡献在于简化了sgRNA构建流程，将传统克隆中耗时最长的酶切-连接步骤替换为PCR扩增和同源重组。对于需要系统筛选多个靶位点的研究项目，这种简化带来的时间节省十分可观。选择KanMX/G418筛选系统也颇为务实——G418筛选在酵母中成熟可靠，且KanMX标记同时服务于大肠杆菌和酵母两个宿主中的筛选，一个标记贯穿全程。
该方案的另一亮点在于“无缝质粒环化”设计。传统方法在插入引导序列时往往会在质粒上留下额外的限制酶位点或短序列“疤痕”，而基于同源重组的环化方式理论上不引入多余序列，保持了质粒结构的完整性。这种设计思维值得关注——它减少了对质粒功能潜在干扰的风险。
当然，该方案的应用效果依赖于引导序列的设计质量。如果sgRNA在靶位点的切割效率不高，“多对少”的菌落对比可能不够明显，给结果判断带来困难。此外，HDR供体的设计质量直接影响编辑结果的准确性，同源臂的长度和突变位点的位置都需要仔细优化。原文摘要未详述同源臂的推荐长度或供体浓度等参数，实际操作中可能需要根据具体位点进行摸索。
总体而言，这一PCR-based引导插入方案为酵母基因编辑提供了一条更简洁的技术路径，尤其适合需要高通量筛选多个引导序列或反复迭代编辑的场景。随着合成生物学对菌株构建效率的要求不断提高，这类简化流程的工具协议将越来越受到研究者的青睐。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protocols. PMID: 42519825.
PMID: 42519825