来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
光遗传学利用光线在基因层面控制细胞功能，已在细胞生理学、生物材料和代谢工程领域展现应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但由于所需基因数量庞大及不同颜色光之间的交叉激活问题，多种波长的光遗传学尚未在酿酒酵母中实现多路复用。本研究开发了一种仅需单基因、无需外源辅因子的紧凑型红光响应光遗传系统，并通过模块化蛋白结构域工程降低了蓝光交叉激活，最终与EL222蓝光系统整合，建立了酵母双通道光遗传平台，实现了黄酮类木犀草素合成的光控及絮凝辅助产物提取。
研究背景
光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比传统化学方法控制细胞功能，具有避免有害化学品、与生物系统正交、动态可控及空间分辨率等优势。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光多种波长的光遗传系统相继开发，多色光分别独立控制不同细胞过程成为独特优势。尽管多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑型正交光遗传系统及颜色间交叉激活问题，酿酒酵母中仅应用了单一波长的单通道光遗传学。酿酒酵母作为遗传学和生物学背景清晰的模式生物，已广泛用于生产高价值化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品及临床治疗等合成生物学应用。
研究方法
双通道光遗传学在生物材料图案化中的应用
本研究涉及的双通道光遗传学最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光模式在特定位置激活细胞中基因表达的能力，对生物材料、神经科学及微生物群落相互作用研究具有重要价值。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投影到携带光敏感启动子控制下有色或荧光基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"打印"到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传学实现了单色图像。
为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了OY-γ.RB（红-蓝）菌株。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。
OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投影到表面（补充图16）。图案被切割到黑纸上作为滤光片，用红光照射选定区域24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在此情况下无需NIR光即可消除交叉激活（补充图17）。利用该方法，研究团队成功印制了从字母到标志及精细图像的多色图案，展示了系统的高空间分辨率及开发复杂活体材料的潜力。
红光通道的构建与测试
将细菌版本iLight直接应用于酿酒酵母存在障碍——该蛋白缺少真核生物功能性所需的激活域和核定位序列。哺乳动物细胞版本则因使用酿酒酵母Gal4 DNA结合域而不具备正交性。为构建适合酿酒酵母的系统，研究团队将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白——LexA常用于正交合成酿酒酵母转录因子。由于细菌变体使用突变LexA域，推测野生型LexA在蛋白构象上具有类似功能。原始SV40 NLS曾融合在Gal4域N端，现重新附加到C端，产生合成酿酒酵母转录因子y-iLight。y-iLight克隆至组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，整合到酿酒酵母基因组YORWd17位点。
依据Stelling等人的设计，构建了同源启动子——由8个串联lexO重复序列阵列位于CYC1核心启动子（cPCYC1）上游组成。为评估不同核心启动子对系统的影响，另行克隆了两个质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆至低拷贝附加体质粒上mCitrine荧光报告基因上游，并转化至表达y-iLight的酵母中（图2a）。
所有3种转化体在光遗传光盒（Optobox）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养。ACT1启动子（PACT1）作为酿酒酵母中特征明确的启动子，广泛用于工业和研究应用。为评估工程启动子能否驱动足够水平的基因表达以应用于实践，将其活性与PACT1进行比较。因此，将y-iLight启动子替换为组成型PACT1并连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与黑暗条件相比，所有三种y-iLight响应质粒在红光照射下均观察到表达增加（图2b），表明iLight已成功改造为在酿酒酵母中无需额外辅因子即可工作。
不同核心启动子导致不同水平的报告基因表达。值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下的OD600均未显示生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的特性所致。一种可能的解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合——靠近核心启动子的转录激活因子结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是"促进扩散"——由于转录因子在DNA链上拥挤，初始结合速率增加但停留时间减少，导致启动子表达不佳。这两种机制都会在活性转录因子高浓度下表现为启动子表达降低。
三种启动子对光的敏感性可能不同，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及RNA聚合酶在转录起始过程中解旋DNA的区域。
研究结果
在酿酒酵母中开发单组分红光通道
多种红光响应转录因子已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发，但其缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子或需要额外基因进行辅因子的内源合成。考虑到双通道系统中基因过多可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种可利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。虽然据作者所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白衍生而来。该蛋白由DNA结合域与IsPadC BphP进化光感受核心模块（PCM）融合组成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变允许DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态转变为失活态（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因其利用内源产生的胆绿素IXa。研究团队推断其在酿酒酵母中功能类似——酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素产生。
红光通道表征
将三种y-iLight响应质粒转化体在0%、2.5%、10%、25%、50%和100%红光强度下培养（图2b）。与黑暗相比，所有红光强度下三种质粒表达均增加，证实iLight成功改造为在酿酒酵母中无需额外辅因子即可工作。PlexCYC1和PlexPGK1在红光超过10%时活性下降，PlexENO1在超过50%时下降。三种核心启动子的非线性行为提示为y-iLight转录因子本身特性。所有条件下OD600无生长缺陷，红光未影响细胞活力。
蓝光通道与交叉激活评估
EL222蓝光光遗传系统在P6CCL启动子下表达mTurquoise荧光报告基因（图2c、d）。BY474B细胞在30°C摇床培养箱中暴露于0%-100%蓝光以及100%蓝光30分钟/黑暗30分钟循环，24小时测定荧光并归一化至OD600。
BY474B在25%红光、25%蓝光或黑暗条件下培养（图3a），红光与黑暗条件结果采用双尾独立t检验进行成对比较。红光对y-iLight的影响实验中（图3b），BY474R在25%红光下培养2小时后，分别继续25%红光、50%NIR光或黑暗处理3小时，每小时测定荧光。结果显示NIR光可逆转红光激活。
为减少蓝光交叉激活，工程化改造了y-iLight变体（图3c），引入光诱导核输出序列和光敏感降解决定子用于模块化工程（图3d）。图3e展示了y-iLight变体在25%红光、25%蓝光、25%蓝光加50%NIR或黑暗条件下的mCitrine表达，结果用双尾独立t检验比较（NS = p > 0.1, = p < 0.1, = p < 0.05, = p < 0.01）。深蓝色括号表示差异显著性，绿色括号表示交叉激活减少，红色括号表示蓝光抑制表达与红光激活表达的倍数差异。y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY在0-100%红光强度下的表达如图3f所示。
双通道同时控制验证
OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY菌株在50%NIR加0-100%蓝光条件下培养（图4a、b），以及在0-100%红光条件下培养（图4c、d），分别测定mTurquoise和mCitrine表达。多光条件实验（图4e、f）中，菌株在30°C摇床培养箱中暴露于60分钟循环：25%红光后25%蓝光、25%红光后25%蓝光加50%NIR光、25%红光加25%蓝光同时照射、以及三种光同时照射。24小时测定荧光并归一化至OD600。
木犀草素合成的光控双通道代谢通量
研究构建了从柚皮素经菱形途径酶促转化为木犀草素的代谢通路（图5a），OY-γ.LutB/R(D)的基因电路如图5b所示。在120分钟周期的不同红蓝光循环条件下培养（图5c），第一个数字表示蓝光加NIR光暴露分钟数，第二个数字表示红光暴露分钟数。24小时后提取黄酮类化合物并用HPLC表征。RT-qPCR结果显示F3'H和FNSI表达随时间变化（图5d、e），ΔCt与黑暗条件比较。12小时蓝光加NIR光后12小时红光的培养条件下（图5f），每6小时提取并表征黄酮类化合物。反向光照顺序（12小时红光后12小时蓝光加NIR）的结果如图5g所示。
数学模型与实验验证
图6a展示了暴露于一个循环不同比例蓝光加NIR光后红光的模拟黄酮浓度。图6b为阐明柚皮素产生木犀草素两条途径调控机制和反应动力学的模型示意图。图6c为120分钟周期不同占空比下24小时的预测黄酮水平。图6d为12小时光照循环的预测时间响应曲线。图6e为模型预测与实验数据比较计算的R²（决定系数）值，条形图上的点表示用于比较的实验数据。
生长-生产-提取三相生物制造
OY-γ.LutFlo的基因电路如图7b所示。图7c展示了OY-γ.LutFlo在不同光照条件下的絮凝照片：黑暗48小时、50%NIR光48小时、或24小时25%蓝光加50%NIR光后24小时25%红光，均在30°C摇床培养箱中进行。图7d展示了培养各阶段上清液的OD600。OY-γ.LutFlo和OY-γ.LutB(D)在不同光照条件下培养，OY-γ.LutFlo额外在48小时黑暗、48小时50%NIR光或24小时25%蓝光加50%NIR光后24小时25%红光条件下培养，各时间点测定上清液OD600（结果用双尾独立t检验比较，NS = p > 0.1, = p < 0.1, = p < 0.05, = p < 0.01）。图7e展示了培养各阶段木犀草素产量：OY-γ.LutB(D)在25%蓝光加50%NIR光下培养30小时，在24和30小时测定黄酮浓度；OY-γ.LutFlo在25%蓝光加50%NIR光下培养24小时后转25%红光6小时，24小时从细胞培养物中提取黄酮，30小时分别从上清液（Top Fraction）和含絮凝物的剩余培养物（Bottom Fraction）中提取黄酮。标记比较的p值为：(i)−0.00421, (ii)−0.777, (iii)−0.00562, (iv)−0.00378, (v)−0.000331。
讨论与解读
本研究成功开发了酿酒酵母单组分红光光遗传系统y-iLight，仅需单一转录因子且不依赖外源辅因子，填补了该领域的空白。与最近开发的PhiReX系统相比——后者需要表达四个不同基因包括合成非内源辅因子的基因——y-iLight更为紧凑。PhiReX 1.1可实现41倍诱导，强度接近天然启动子PADH1；PhiReX 1.0可达PADH1约2倍强度但仅11倍诱导。y-iLight诱导倍数为26倍，活性与另一天然启动子PACT1相当，动态范围介于PhiReX 1.0和1.1之间。
一个意外发现是蓝光与红光通道之间存在交叉激活——y-iLight的光敏辅因子胆绿素在基态吸收可见光谱红光范围，这限制了双通道同时使用的正交性。通过模块化蛋白结构域工程（引入光诱导核输出序列和光敏感降解决定子），研究团队成功降低了蓝光交叉激活，实现了更可靠的双通道控制。
编译者解读
本研究的意义在于将酵母光遗传从单色推向双色正交控制，且红光系统仅需单基因、利用内源辅因子，大幅降低了代谢负担和克隆复杂度。从合成生物学应用角度看，将双通道光控与絮凝辅助产物提取结合形成"生长-生产-提取"三相流程，以及利用空间光图案化开发活体材料，都体现了光遗传在生物制造中的实际价值。不足之处在于红光通道在高光强下呈现非线性响应，机制尚需深入探讨；交叉激活虽经蛋白工程优化有所缓解，但未完全消除，未来可考虑定向进化进一步改善光谱特异性。
参考来源
Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nature Communications. PMID: 42173879.
PMID: 42173879