来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理过程产生的低pH、高温及发酵抑制物等苛刻条件，对微生物宿主提出了极高要求。本研究以具有天然多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现模式酵母酿酒酵母的表面展示组件在该酵母中失效后，基于内源 IoSED1 基因构建了功能性表面展示系统，成功实现了eGFP和β-葡萄糖苷酶的细胞表面固定化，并证实展示菌株能在纤维二糖为唯一碳源且存在抑制物的条件下稳健生长。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭，推动社会对脱离化石原料的可持续生产体系需求日益迫切。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残留物——因来源丰富且不与粮食作物争地，成为最具潜力的替代原料之一。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，其中纤维素和半纤维素可经化学与酶处理水解为可发酵的单糖（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖），进而由代谢工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母因抗噬菌体感染、遗传操作便利、异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化中颇具潜力的宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。将纤维素酶通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白的锚定域展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的预处理（如酸性热化学处理）会造成低pH、高温及发酵抑制物共存的严苛培养环境，因此展示纤维素酶的宿主菌株必须具备对这些胁迫的显著耐受性。本研究选用具有突出多胁迫耐受性的非常规酵母I. orientalis，尝试在该酵母中建立细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
Escherichia coli NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）作为重组DNA操作宿主。E. coli转化子在Luria-Bertani培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L）中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，培养温度37 °C。本研究所用的I. orientalis野生型菌株共11株，购自NITE生物资源中心（NBRC，日本东京）；酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所用酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母培养培养基为YPD（酵母提取物10 g/L、Bacto-蛋白胨20 g/L [Difco Laboratories，美国密歇根州]、葡萄糖20 g/L）、SC-URA dropout培养基（不含氨基酸的酵母氮碱6.7 g/L [Difco Laboratories]、不含尿嘧啶的酵母合成dropout培养基补充物1.92 g/L [Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、葡萄糖20 g/L）或SD培养基（不含氨基酸的酵母氮碱6.7 g/L [Difco Laboratories]、葡萄糖20 g/L）。
I. orientalis NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将I. orientalis和S. cerevisiae细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl和0.5 M KOH调节至2或6。培养在L形管中进行，使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，日本东京）于30 °C或45 °C、40 rpm振荡培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香兰素）的耐受性，细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600分别为1、0.1、0.01、0.001），取各稀释液3 µL点样于补充了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，日本东京）记录菌落生长情况。
I. orientalis NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，日本大阪）提取I. orientalis NBRC1664基因组DNA。I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂分别用URA3-UP-F/URA3-UP-R引物和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增（Xiao等，2014）。这些片段通过重叠延伸PCR融合，所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在补充1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。IoURA3 ORF的敲除通过菌落PCR用Colony-P-F和Colony-P-R引物确认。为验证尿嘧啶营养缺陷型，转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线，于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，日本滋贺县）按制造商说明构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
IoURA3基因的DNA片段用URA3-F和Colony-P-R引物从I. orientalis NBRC1664基因组DNA经PCR扩增。扩增片段导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到pVT。用于增强绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示的基因表达盒（来自质粒pleGFP-SSS，Inokuma等，2020）用ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物PCR扩增，导入pVT的SacI位点，得到质粒pVT-SceGFP。
IoSED1编码区（除分泌信号外，见表S4）用IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物从I. orientalis NBRC1664基因组DNA经PCR扩增。扩增片段与以质粒plBG-SSS（Inokuma等，2016）为模板、Vector-F和Vector-R引物PCR产生的DNA片段融合。所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定域被替换为IoSED1锚定域。用于以IoSED1启动子、分泌信号和锚定域展示eGFP的质粒构建如下：含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段用IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物从I. orientalis NBRC10737基因组DNA经PCR扩增；eGFP编码区DNA片段用eGFP-F和eGFP-R引物从pleGFP-SSS扩增；编码IoSED1锚定域的DNA片段用IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物从plBG-SSIoS经PCR扩增。这三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入I. orientalis NBRC1664染色体2上先前鉴定的基因间位点IS2（Lee等，2022）的整合型质粒构建如下：IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段分别用IS2-UP-F/IS2-UP-R引物和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R引物从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增。在IS2-UP-R的重叠区域插入一个PacI识别位点。这两个DNA片段通过重叠延伸PCR融合，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。pVT-IoeGFP中用于展示eGFP的基因表达盒用IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物PCR扩增，所得片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于展示Aspergillus aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：IoSED1启动子和分泌信号以及IoSED1锚定域的DNA片段分别用IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2引物和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2引物从pVT-IoeGFP扩增。编码A. aculeatus BGL1的DNA片段用BGL-F和BGL-R引物从plBG-SSS经PCR扩增。这三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的I. orientalis菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT同样导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。为实现eGFP展示盒的基因组整合，整合型质粒pVT-IS-IoeGFP用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的I. orientalis菌株，整合型质粒pVT-IS-IoBGL用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoBG-int菌株。
所有I. orientalis菌株均采用醋酸锂法转化（Xiao等，2014），略有修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养。取等分试样接种至3 mL新鲜YPD培养基中，继续培养至OD600达到0.5–1.0。收集细胞，用无菌水洗涤两次，重悬于转化缓冲液（100 mM醋酸锂、10 mM Tris-HCl [pH 7.5]、1 mM EDTA）中。向细胞悬液中加入质粒DNA（约1 µg）和变性鲑鱼精DNA（100 µg），混匀后加入40% PEG 3350溶液（终浓度33%）。混合物于30 °C孵育30 min，随后42 °C热激15 min。细胞经洗涤后涂布于相应选择性SC琼脂平板，30 °C培养2–4天直至菌落出现。
研究结果
I. orientalis NBRC1664多胁迫耐受性评估
为比较I. orientalis与模式酵母S. cerevisiae的多胁迫耐受性，我们评估了I. orientalis NBRC1664（从NBRC获得的11株I. orientalis菌株中最耐受的一株，图S1）和S. cerevisiae BY4741在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，在pH 6条件下两物种均生长良好，且I. orientalis的生长优于S. cerevisiae。I. orientalis在pH 2条件下表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同，而S. cerevisiae在pH 2条件下无法生长。类似地，在45 °C条件下I. orientalis成功生长而S. cerevisiae不能；两菌株在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。
进一步地，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香兰素）存在下的生长情况，进行了点样分析（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的浓度范围内（Mills等，2009）。在补充了适量营养物的SD培养基上，两物种在非胁迫条件下均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而S. cerevisiae在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上，这些结果表明I. orientalis NBRC1664具有卓越的多胁迫耐受性。
展示eGFP的I. orientalis菌株评估
为确定与GPI锚定域融合的蛋白能否固定在I. orientalis细胞表面，我们构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先，尝试表达先前已证明能在S. cerevisiae细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma等，2020），该表达盒由S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定域以及S. cerevisiae SAG1终止子组成（图2a）。携带该盒的附加型质粒（pVT-SceGFP）导入I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株（尿嘧啶营养缺陷型，其尿嘧啶营养缺陷已通过生长分析确认，图S2），并按"材料与方法"所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
接下来，我们推测荧光的缺失源于盒内异源遗传元件在I. orientalis中功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定域对展示效率有决定性影响（Inokuma等，2014，2016；Zhang等，2013）。因此，我们构建了一个修饰型展示盒，其中上述各元件均被替换为IoSED1基因的对应元件（图2a）。IoSED1与ScSED1基因同源（Kitagawa等，2010），且基于big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber等，2004），其编码产物被预测为GPI锚定蛋白。此外，源自IoSED1基因的信号序列已被报道能介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa等，2010）。将该新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察到清晰的表面定位荧光（图2b）。该荧光模式与展示eGFP的S. cerevisiae菌株中观察到的模式相当（Inokuma等，2020），表明eGFP成功展示在I. orientalis细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅在有限数量的细胞中观察到荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，我们将展示盒整合至基因组。按"材料与方法"所述构建了设计用于将盒插入I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee等，2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，表现出清晰表面定位信号的细胞比例大幅增加（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综上，这些结果证明成功构建了能使目标蛋白展示在I. orientalis细胞表面的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的I. orientalis菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，我们构建了展示A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao等，1988）的I. orientalis菌株，得到16-IoBG-int菌株（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h，随后在30 °C下评估细胞组分和培养上清液中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清液中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示在I. orientalis细胞表面。
此外，为评估所展示的A. aculeatus BGL1在LCB生物转化中预期的高温条件下的活性（Yanase等，2010），将在30 °C培养72 h的细胞置于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著增加至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与A. aculeatus BGL1的最适温度在50 °C以上高温区间的已知特性一致（Murao等，1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵实验
为评估所构建的展示BGL的菌株能否在胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源生长，将16-IoBG-int菌株在含1.9%纤维二糖和0.1 M MOPS（pH 6.5）的SC培养基中培养。如图4a所示，16-IoBG-int菌株在纤维二糖上表现出稳健生长，而亲本菌株NBRC1664/ura3Δ几乎不能生长。培养过程中对残留纤维二糖浓度的监测显示，16-IoBG-int菌株在培养过程中消耗了纤维二糖（图4b），证实其能够利用纤维二糖作为碳源。
进一步地，为模拟LCB生物转化中的实际胁迫条件，在含25.4 mM 5-HMF或100 mM乙酸的上述培养基中培养16-IoBG-int菌株。结果显示，该菌株在存在5-HMF（图4c）或乙酸（图4d）的条件下仍能维持生长，尽管生长速率有所降低。这些结果表明，展示BGL的I. orientalis菌株即使在木质纤维素来源的抑制物存在下，也能以纤维二糖为唯一碳源进行同化和生长。
讨论与解读
本研究开发了一种适用于多胁迫耐受酵母I. orientalis的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长。更重要的是，该菌株在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的I. orientalis菌株非常适合高效的LCB生物转化。
研究采用源自IoSED1基因的启动子、分泌信号和锚定域构建了新基因表达盒，并成功展示了eGFP。基因组整合展示盒后，展示eGFP荧光的细胞比例较附加型质粒表达系统大幅提高，暗示质粒表达在I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。这一解释与先前报道一致——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的附加型质粒在另一株I. orientalis中表现出不稳定性（Tran等，2019；Cao等，2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍可观察到部分无荧光细胞。值得注意的是，如图2b所示，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光，这可能与细胞周期或细胞壁结构差异有关，原文未详述。
编译者解读
本研究的关键价值在于证实了"模式酵母的展示组件不可直接移植"这一工程问题，并通过同源化改造（将启动子、分泌信号、锚定域全部替换为宿主内源元件）加以解决——这对其他非模式酵母的蛋白展示研究具有直接借鉴意义。基因组整合策略显著提升了展示阳性率，为后续工业化应用提供了更稳定的遗传背景。BGL展示菌株在45 °C下酶活提高3倍以上，恰好契合LCB预处理后高温同步糖化发酵的需求。一个值得关注的局限是：研究仅验证了BGL单酶的展示，而完整的纤维素降解需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶与BGL的协同作用。多酶共展示体系能否在I. orientalis中实现，是这一平台走向实际应用的关键下一步。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235. DOI: 10.1007/s00253-025-13500-1
PMID: 42154235