来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
抗生素滥用引发的环境耐药基因扩散已成为全球公共卫生危机。本研究从土耳其卡奇卡尔山脉冷水环境中分离到一株假单胞菌R11S16，从中克隆了一个YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化获得重组酯酶PsEstyfh。该酶分子量仅约23 kDa，具有冷活性、耐碱、耐盐等特性，能在20 °C、pH 9条件下高效催化短链对硝基苯酯水解，并可将阿奇霉素的抗菌活性降低95%以上。这是首次报道来源于P. sivasensis的该类酯解酶的重组生产与功能表征。
研究背景
抗生素在人类医疗、畜牧养殖及食品保藏中的不当使用，导致全球抗菌素耐药性（AMR）快速上升，已成为公共健康的重大威胁。耐药性不仅限制患者治疗选择，还通过增加发病率、死亡率和住院时间给医疗系统带来沉重经济负担。据估计，仅美国每年就有超过35,000人死于耐药菌感染；若当前趋势持续，到2050年全球每年因抗生素耐药导致的死亡人数可能超过1,000万。此外，AMR造成的全球经济年损失据报道超过1,000亿美元。释放到自然环境中的抗生素即使在低浓度下也会产生选择压力，加速耐药基因的发育与传播，从而在环境抗生素污染与抗生素耐药性之间建立了直接联系。在此背景下，从冷适应微生物中发掘新型酯酶用于抗生素降解，成为环境生物修复的潜在策略。
研究方法
材料与试剂
克隆所用酶、缓冲液及无核酸酶水购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA）。甘油、牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝R-250、β-巯基乙醇（βME）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸、正磷酸、溶剂及对硝基苯酚（p-NP）连接底物购自Sigma-Aldrich（Darmstadt, Germany）。培养基和缓冲液组分购自Merck（Darmstadt, Germany）。乙二胺四乙酸（EDTA）购自PanReac Applichem（Barcelona, Spain）。其他试剂和实验器材（玻璃/塑料）除非另有说明，均购自Tekkim（Bursa, Turkey）、Biobasic（Toronto, Canada）、AnalytiChem（Zedelgem, Belgium）和Condalab（Madrid, Spain）。
菌株的分子鉴定
一株耐冷菌株R11S16分离自卡奇卡尔山脉采集的水样（GPS坐标：40°52′54.01″ N, 41°08′23.26″ E）。以R2A琼脂为分离培养基，通过营养琼脂反复划线纯化分离株R11S16。使用PureLink® DNA分离试剂盒（Invitrogen, USA）按制造商说明从过夜培养物中提取基因组DNA。利用通用细菌引物（27F和1525R）通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR产物纯化后，使用ABI PRISM 3730 XL自动测序仪，以正向引物518F和反向引物800R进行测序。
ABI格式的色谱文件用Chromas 1.45版检查，引物重叠拼接获得分离株R11S16的16S rRNA基因核苷酸序列（FASTA格式）。所得16S rRNA基因序列已提交GenBank，登录号为PP213417。将该序列上传至EzBioCloud服务器进行最近邻系统发育菌株的两两序列相似性分析。使用MEGA X软件包，采用邻接法（neighbor-joining）、最大简约法（MP）和最大似然法（ML）构建系统发育树。树拓扑结构通过1000次bootstrap重抽样评估。由于本研究主要聚焦于冷活性酯酶的功能表征，未进行基因组水平的分类学分析。
YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因的克隆
基于Pseudomonas sivasensis模式菌株基因组数据设计两端含XhoI酶切位点（斜体）的寡核苷酸引物，用于扩增YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因。使用NEB cutter v3.0（https://nc2.neb.com/NEBcutter2/?noredir）分析基因的限制性酶识别位点，使用SignalP-6.0网络工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）分析可能的信号肽。使用Thermo Fisher Scientific Multiple Primer Analyzer（https://www.thermofisher.com）评估设计的引物形成引物二聚体的可能性。使用NEB Tm Calculator网络工具计算熔解温度，并考虑PCR反应中使用的DNA聚合酶。
通过离心10,000 × g、10 min收集P. sivasensis R11S16过夜新鲜培养物细胞，使用Invitrogen™ PureLink™ Genomic DNA Mini Kit按制造商指南提取基因组DNA。使用正向引物（5′-ATTCTCGAGCTGTATATCCACGGTTTC-3′）和反向引物（5′-AATCTCGAGCAGTGCCGAAAAATC-3′）扩增YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因。扩增反应在热循环仪微量离心管中进行，反应体系含：10X Taq缓冲液（3 µL）、Taq DNA聚合酶（0.25 µL，1.25 U）、基因组DNA（3 µL）、10 µmol正向引物（0.8 µL）、10 µmol反向引物（0.8 µL）、10 mM dNTP（0.8 µL）和无核酸酶水（18.95 µL）。反应混合物在热循环仪（Biorad-T100™, Hercules, CA）中先于95 °C预变性2 min，随后进行30个循环：95 °C变性40 s，60 °C引物退火40 s，72 °C延伸60 s，最后72 °C终延伸5 min。使用FavorPrep™质粒提取试剂盒（Favorgen, Pintung, Taiwan）从E. coli DH5α细胞中提取质粒pET20b(+)。PCR产物和pET20b(+)分别用XhoI（# ER0691）按制造商指南进行酶切。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后用GeneJET凝胶提取试剂盒回收，取6 µL PCR产物和2 µL线性化pET20b(+)进行连接，反应体系含1 µL 10X T4 DNA连接酶缓冲液、0.5 µL 5U/µL T4 DNA连接酶（# 15224041）和0.5 µL无核酸酶水，于25 °C连接过夜。取连接混合物（3.5 µL）按Chung和Miller（1993）描述的热激转化方案导入CaCl₂-感受态E. coli DH5α细胞（50 µL）。转化子在含终浓度50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长，随后对转化子重复提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，通过比较长度鉴定含重组分子的克隆。之后，将验证的重组分子用相同转化方法亚克隆至E. coli BL21(DE3)中进行异源表达。
异源表达与纯化
取含重组分子的克隆一环，接种至装有50 mL含氨苄青霉素LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，于37 °C、175 rpm振荡培养至光密度（OD600）达到0.4–0.6。随后向培养物中加入IPTG至终浓度0.3 mM，继续在18 °C、175 rpm条件下振荡培养5 h。培养结束后，培养物于10,000 × g离心5 min，回收上清液作为粗酶液。通过SDS-PAGE和酯酶活性测定验证表达情况。
粗酶液经10-kDa分子量截留（MWCO）再生纤维素超滤膜（Ultracell®, Merck Millipore, MA, USA）在Amicon™-搅拌超滤池（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）中浓缩。取等体积浓缩粗酶液与HisPur™ Ni-NTA树脂（Thermo Scientific™）轻轻混合，于4 °C保持1 h。未结合蛋白用磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.4）洗脱通过柱体，结合蛋白用洗涤缓冲液中100–400 mM咪唑线性梯度洗脱，流速0.3 mL/min。收集具有酯酶活性的级分（每份1 mL），合并、浓缩，并对50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）透析，供后续研究使用。
SDS-PAGE分析、总蛋白定量与酯酶活性测定
SDS-PAGE分析在10%丙烯酰胺凝胶上进行，采用Laemmli（1970）方法的改良版。电泳使用Mini-Protean Tetra Cell电泳系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）进行，考马斯亮蓝染色后蛋白条带用Gel Doc XR系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）成像。酶溶液总蛋白浓度按Bradford（1976）方法，使用牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行定量。酯酶活性通过分光光度法在410 nm波长下监测对硝基苯酚释放量进行测定。
研究结果
菌株R11S16的系统发育归属
获得菌株R11S16近完整的16S rRNA基因序列（1459 bp）。比较序列分析显示，菌株R11S16与Pseudomonas sivasensis P7T的序列相似性为100.0%，其次为Pseudomonas petroselini MAFF 311,094T（99.93%）和Pseudomonas extremaustralis 14-3T（99.86%）。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析将菌株R11S16归属于假单胞菌属，与P. sivasensis P7T紧密聚为一簇（图1）。可比较的树拓扑结构表明菌株R11S16的系统发育位置稳定且一致。尽管若干密切相关的假单胞菌物种表现出较高的16S rRNA基因序列相似性，菌株R11S16在所有系统发育重建中始终与P. sivasensis谱系的模式菌株聚在一起，并获得强bootstrap支持。菌株R11S16在胰蛋白胨大豆琼脂上形成光滑、圆形、奶油色菌落（图1），与假单胞菌属成员常见的表型特征一致。值得注意的是，分析中包括的若干系统发育相关物种此前已从寒冷或温带环境中分离报道，支持菌株R11S16作为耐冷细菌和冷活性酶潜在来源的生态相关性。基于16S rRNA基因序列相似性和与模式菌株的系统发育聚类，菌株R11S16被鉴定为P. sivasensis。该分子鉴定水平被认为足以为此后聚焦于菌株R11S16所产冷活性酯酶的生化表征和工业潜力的分析提供可靠的分类学框架。
克隆、异源表达与纯化
从P. sivasensis R11S16分离株基因组DNA中PCR扩增的YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因（yfh）经电泳分析，在0.8%琼脂糖凝胶上观察到约600 bp的单一条带，与预期一致。扩增的yfh基因和pET20b(+)成功经XhoI酶切、连接，由此构建的重组分子（pET20b(+)-yfh）转化至E. coli DH5α。在含氨苄青霉素的培养基中37 °C过夜生长的转化子，通过比较快速提取质粒的大小筛选含有pET20b(+)-yfh的克隆。重组分子中的插入片段通过使用通用T7启动子引物（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和T7终止子引物（5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）测序鉴定。由此验证了重组分子及基因方向。此外，克隆基因与模式菌株P. sivasensis中的同源基因使用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa）进行比对，并在Jalview中可视化。据此，分离株R11S16的yfh基因第108、254、256、257、275和297位核苷酸与P. sivasensis模式菌株不同。基于NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）数据库的蛋白质分析结果显示，该基因产物的氨基酸序列与来自P. sivasensis（蛋白质登录号：WP_181640331.1）、Pseudomonas cyclaminis（蛋白质登录号：WP_122305492.1）、Pseudomonas fluorescens（蛋白质登录号：WP_191946927.1）、Pseudomonas grimontii（蛋白质登录号：WP_090400878.1）、Pseudomonas rhodesiae（蛋白质登录号：WP_348749120.1）和Pseudomonas azotoformans（蛋白质登录号：WP_071497189.1）的YqiA/YcfP家族α/β水解酶分别有97.0%、96.5%、95.5%、95.5%、95.0%、94.5%和94.0%的差异。最后，验证的重组分子被亚克隆至E. coli BL21(DE3)。
yfh基因在T7启动子控制下以组氨酸标签（6X-His）形式胞外表达。基因表达通过SDS-PAGE分析评估（图2a）。在丙烯酰胺凝胶上，与含和不含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液相比，含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液中观察到分子量约23 kDa的独特蛋白条带，证明yfh基因的表达。此外，从含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)经IPTG诱导的培养物中回收的粗酶液酯酶效价为56.83 ± 0.82 U/mL。相比之下，在相同条件下生长的含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)培养物中未检测到胞外酯酶活性。表达的重组蛋白被命名为PsEstyfh。PsEstyfh的比活力为170.10 ± 5.09 U/mg蛋白。SDS-PAGE分析还显示，该酶的分子量低于来自Pseudomonas sp. TB11、Serratia sp.、Zunongwangia profunda、Bacillus halodurans、Pseudomonas sp. E2-15、Deinococcus radiodurans、Pseudomonas sp. E5-12、Aphanizomenon flos-aquae、Arthrobacter soli、Halobacterium salinarum、Haloarcula japonica和Aspergillus niger的冷活性酯酶。另一方面，其分子量与来自Psychrobacter pacificensis、Bacillus cohnii和Lysinibacillus sp.的冷活性酯酶相似。总之，PsEstyfh可能是迄今报道的最小的冷活性酯解酶。PsEstyfh的小尺寸特性使其值得与其他冷活性酶（尤其是漆酶）构建融合蛋白用于生物修复。
PsEstyfh的生物信息学分析
Protparam分析确认所表达酶的分子量约为23,024.75 Da。分析显示该酶的等电点为6.11，在大肠杆菌中的半衰期超过10 h。PsEstyfh的不稳定指数计算为37.26，表明该酶在体外具有合理的稳定性。
温度、pH和NaCl对PsEstyfh活性的影响
金属离子和化学试剂对PsEstyfh活性的影响
有机溶剂对PsEstyfh活性的影响
PsEstyfh的底物特异性与动力学参数
分子对接分析
PsEstyfh对阿奇霉素的降解潜力
降解产物的生态毒理学评估
讨论与解读
本研究报道了来源于P. sivasensis R11S16的一种此前未表征的酯解酶，并成功在大肠杆菌中表达。该酶展现出罕见的理想生化特性组合，包括低温下的强活性、碱性pH偏好、在宽pH范围内的显著稳定性、对多种添加剂（NaCl、溶剂、金属离子和化学试剂）的中等耐受性以及紧凑的分子结构。这些特性使其在废水处理应用中尤为有用。此外，该酶几乎完全消除阿奇霉素抗菌活性的能力，以及过程中释放的转化产物未产生毒性效应的事实，凸显了PsEstyfh作为大环内酯类抗生素生物催化去除和减少环境耐药性传播的有前景工具。除环境应用外，该酶还适用于洗涤剂、纺织和制药工业。此外，酶的小分子尺寸为合成生物学应用提供了显著优势，特别是在设计多功能融合酶以扩展催化多功能性、去除结构多样的外源化合物方面。
编译者解读
PsEstyfh的独特价值在于其"小而冷"的组合特性——23 kDa的分子量使其成为已知最小的冷活性酯酶之一，这对构建多功能融合酶极为有利。研究者选择从耐冷假单胞菌中挖掘酯酶，策略上瞄准了低温工业催化的真实需求。阿奇霉素降解实验从酶学表征延伸至生态毒理学评估，体现了环境修复研究的完整逻辑链。不过，该研究仍停留在实验室规模，酶在真实废水基质中的表现、固定化策略及规模化生产的经济性均有待验证。将PsEstyfh与其他水解酶或漆酶构建融合蛋白，可能是其走向应用的务实路径。
参考来源
Çon G, Karakaya E, Saygin H, Saricaoğlu S, Könen Adıgüzel S. Heterologous expression of a cold-active small esterolytic enzyme from Pseudomonas sivasensis R11S16 and its potential for azithromycin removal. 3 Biotech. PMID: 42245393. DOI: 10.1007/s13205-026-04884-y.
PMID: 42245393