来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷结构的稀有皂苷，生物活性显著，但在栽培人参中天然不产生。本研究组装了染色体级别的东北刺人参（Oplopanax elatus）基因组，通过比较基因组学和生化分析，鉴定出专职催化达玛二烯醇合成的OSC14酶，揭示其由祖先多功能三萜合酶经复制和新生功能化进化而来。单个N260Y氨基酸替换即可逆转这一进化转变。研究进一步在烟草中重构RK型人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的完整生物合成途径，为三萜多样性进化提供了新见解，也为植物源生产这些高价值化合物开辟了新路径。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为核心、经糖基修饰形成的重要次生代谢物，已报道超过20,000种结构。它们不仅具有抵御病虫害、塑造根际微生物组和影响作物品质的生态功能，还表现出免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性。人参（Panax ginseng）含有数百种结构各异的人参皂苷单体，主要基于达玛烷骨架，在C-3、C-6和/或C-20位发生不同糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，相比母体化合物疏水性增强。与新鲜人参组织中占主导的普通人参皂苷不同，RK型人参皂苷在栽培人参中几乎不存在，通常通过热处理或酸处理（如红参加工中的蒸制）获得。东北刺人参作为人参的近缘物种，能够积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，却不产生RK型人参皂苷。这一独特的代谢表型为研究三萜骨架多样化的进化机制提供了理想体系。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。该种群在室外遮阴区域栽培，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘以保持根系完整，快速清洗后立即用液氮冷冻，并于−80 °C保存备用。各组织类型的外观如图1B所示。采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为生成PacBio HiFi长读长数据，取总计15 µg高分子量DNA，使用gTUBE剪切，随后用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统进行大小选择，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi共有序列在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程，Hi-C文库定量后在MGIseq-2000测序平台上测序。
基因组从头组装与质量控制
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读长结合Hi-C数据组装。首先用SOAPnuke v.1.5.3过滤原始Hi-C数据获得高质量clean reads（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读长使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并纳入Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定到染色体上，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）进行Hi-C数据的过滤、排序和定向。最终使用Juicebox v.1.11.08手动校正组装，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
采用从头预测和同源比对相结合的策略鉴定东北刺人参基因组中的重复序列。首先用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外，用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组内的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果，包括总重复含量和详细家族组成，见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种的蛋白序列用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）比对到组装基因组，再用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果和相应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，用同源预测的基因结构训练HMM模型，再用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，RNA-seq数据先用HISAT2 v.2.2.1比对到基因组，用StringTie v.2.2.0将比对读长组装成转录本，用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并进一步优化转录本模型。最后用MAKER2整合三种方法预测的基因模型，生成高质量基因集。功能注释方面，用BLASTP（E值<1e-10）将预测基因的蛋白序列比对到SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP命中分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涉及东北刺人参及18个其他植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。基因家族用OrthoFinder v.2.5.5默认参数聚类。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取phase 1或四重简并（4D）位点，用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然（ML）系统发育树，1000次bootstrap重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的四重简并位点进一步用于PAML v4.9j包中的MCMCTree程序估算物种分化时间。分歧时间在贝叶斯框架下用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断，参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分歧时间。基因家族扩张和收缩用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
种内旁系同源基因对方面，先用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，用PAML中codeml在F3X4模型下计算各共线性区块内基因对的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排序选择最佳命中基因对，用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2，基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT）在东北刺人参中进行，E值阈值<0.01。预测蛋白序列用SeqKit v.2.6.1软件按长度进一步筛选：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。筛选后的基因家族成员用在线工具Conserved Domain Database验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列连同东北刺人参的预测家族成员进行系统发育分析。所有序列见补充数据3–6。多序列比对用MAFFT v.7.518默认参数进行。最大似然系统发育树用FastTree v.2.2默认设置构建。所得Newick格式树用iTOL在线平台可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant总RNA提取试剂盒提取总RNA。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，此前对根和根茎提取物的研究报道以齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜为主。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，我们对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物在m/z 189的总离子色谱图（TICs）和提取离子色谱图（EICs）中，在37.15分钟处出现一个显著的未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法据此鉴定结构（图1D）。因此，我们对叶片中P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱确定其结构为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估东北刺人参中是否积累RK型人参皂苷，我们使用市售的Rk1、Rk2和Rk3人参皂苷标准品进行了靶向LC–MS分析。这三种人参皂苷在叶片或所检其他组织中均未检测到（图1E–G和补充图9）。这些发现共同表明，东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参的基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，我们生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参的单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合度高达8.5%（补充图10）。共产生45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读长和126.91 Gb（约71×）Hi-C读长用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定到24条假染色体上的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整度高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装63.68%的重复序列，并预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，我们分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。基于145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高支持率分支：一个包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一个包含辽东楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。这一拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B分别形成两个独立分支，并分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚类，这与两个物种共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能源自一个类二倍体五加科的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群（使用TimeTree化石校准）的MCMCTREE分歧时间估算将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，两个主要五加科谱系的分离定在约28.5百万年前。重要的是，东北刺人参的亚基因组A和B在约23.2百万年前分化，早于辽东楤木–人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种的基因组，获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度表达，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。我们因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共有峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与Vitis vinifera之间2:1共线性关系的进一步支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种在约0.1处表现出额外的Ks峰，而二倍体物种中不存在该峰。每个异源四倍体内两个亚基因组之间的直系同源基因对也在约0.1处显示一个峰。与此模式一致，共线性分析揭示了V. vinifera、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在共有WGD之后发生的相对较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，我们假设东北刺人参基因组编码一种氧化角鲨烯环化酶（OSC），特异性催化2,3-氧化角鲨烯环化形成达玛二烯醇。为验证这一假设，我们使用已知人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19；补充数据2）。
RK型人参皂苷生物合成途径的重构
基于上述发现，我们提出了东北刺人参和人参中RK型人参皂苷的生物合成路线图（图6A）。在东北刺人参中，OeOSC14催化达玛二烯醇的合成，但C12羟化酶的功能缺失阻断了下游氧化步骤，导致RK型人参皂苷无法产生。为验证这一假设并实现RK型人参皂苷的异源生产，我们在本氏烟草中进行了途径重构实验。将tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2共表达后，GC–MS分析（m/z 202）检测到与标准品保留时间窗口匹配的产物峰（图7A）。进一步引入UGT基因后，LC–MS分析在m/z 665.430处检测到人参皂苷Rk3的产物峰（图7B），在m/z 649.435和811.488处分别检测到Rk2和Rk1的产物峰（图7C）。MS碎裂谱确认了这些产物的结构（图7D）。产量分析显示，Rk1、Rk2和Rk3在本氏烟草中均实现了从头生产（图7E）。
讨论与解读
本研究通过染色体水平基因组组装、比较基因组学和生化分析，揭示了东北刺人参中达玛二烯醇合酶OeOSC14的进化起源——由祖先多功能三萜合酶经复制和新生功能化而来。单个N260Y氨基酸替换即可将达玛二烯醇特异性酶逆转回多功能三萜合酶，这一发现精确刻画了三萜合酶功能特化的分子机制。研究还证明，C12羟化酶的功能缺失是东北刺人参无法产生RK型人参皂苷的关键瓶颈。在烟草中成功重构Rk1、Rk2和Rk3的完整生物合成途径，不仅验证了途径假设，更建立了植物源生产这些高价值化合物的可行平台。
编译者解读
该研究展示了"基因组挖掘—进化分析—途径重构"的完整策略在合成生物学中的应用价值。通过解析天然突变体（东北刺人参）中前体积累但产物缺失的代谢表型，精准定位了途径中的关键酶和缺失步骤，这种利用天然变异指导途径设计的方法值得借鉴。在烟草中重构完整途径实现三种RK型人参皂苷的从头合成，为工业化生产提供了植物基平台。不过，当前产量仍处于较低水平，后续需通过酶工程改造、代谢流量优化和规模化发酵等手段进一步提升。该工作也为其他稀有天然产物的途径解析和异源生产提供了可复用的研究范式。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nat Commun. PMID: 42342661.
PMID: 42342661