来源：J Genet Eng Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
丁二胺，又称腐胺，是聚酰胺工业的重要单体，也是多胺代谢的核心分子。微生物发酵法生产丁二胺长期受制于代谢通量失衡——前体供给与产物合成两条路线难以同步优化。近期发表于 Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 的一项研究，以模块化代谢工程策略重新划分大肠杆菌的丁二胺合成网络，试图破解这一瓶颈。
该研究将丁二胺生物合成路径拆解为"产物合成模块"与"α-酮戊二酸供给模块"，通过同四聚酶切位点的多基因串联表达系统，实现了模块内基因的精细调控与模块间的通量平衡。最终，工程菌株的丁二胺产量较对照菌株提升至2.1 g/L。这一结果验证了模块化拆分策略在复杂代谢网络改造中的实用性。
研究背景
大肠杆菌天然具备合成丁二胺的部分代谢途径，但其合成效率远不能满足工业化需求。丁二胺的合成与鸟氨酸代谢紧密相连，涉及TCA循环中α-酮戊二酸的流向分配。直接过表达限速酶往往导致代谢中间产物积累，或引发辅因子失衡，反而抑制菌株生长。
传统代谢工程改造常采取"逐一过表达"的策略，但这种方法难以协调多基因之间的表达比例，也无法动态响应胞内代谢环境的变化。该研究团队选择模块化代谢工程作为核心策略，将完整的丁二胺合成路径拆解为两个功能模块，分别强化产物合成与关键前体供给，再通过系统性的组合优化实现整体通量的提升。
研究方法
菌株与质粒系统
研究选用 E. coli MG1655 和 E. coli BL21(DE3) 作为合成丁二胺的底盘菌株，E. coli JM109 作为质粒构建的克隆宿主。菌株和质粒构建过程中，细胞在含有适当抗生素的 LB 固体平板上培养。抗生素使用浓度如下：卡那霉素 50 mg/mL，氨苄青霉素 80 mg/mL，氯霉素 25 mg/mL，链霉素 50 mg/mL。
目的基因通过匹配引物和相关宿主基因组 DNA 为模板进行扩增。异源基因以 E. coli MG1655 和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）13032 基因组为模板进行扩增。研究中使用的质粒和菌株列于补充表1，引物列于补充表2。
质粒构建
pRSM3 载体使用 Nde I 和 Kpn I 或 Xho I 进行双酶切。酶切后的载体与目标片段具有相同的粘性末端（Nde I 和 Kpn I 或 Xho I），随后通过连接酶将双链 DNA 连接，构建 pRSM3 表达质粒。
研究中使用的 pACM4、pCDM4、pRSM3 和 pETM6 质粒具有四个重要的酶切位点：Bln I、Xba I、Nhe I 和 Spe I。这四个限制性内切酶的粘性末端均为 CTAG，因此被称为同四聚体酶。在多基因串联构建过程中，利用同四聚体质粒系统，首先将待过表达基因通过 Nde I 和 Xho I 构建到原始质粒中，然后选择其中一个质粒作为载体进行回收。
丁二胺模块化合成路径的系统改造
大肠杆菌合成丁二胺的代谢路径较长，与鸟氨酸生产密切相关。研究将完整的丁二胺代谢路径重新定义为两个模块：丁二胺生产模块（模块1）和 α-酮戊二酸生产模块（模块2）。基于大肠杆菌丁二胺合成路径，各基因涉及的代谢路径和功能如图3-1所示。
丁二胺生产模块的代谢改造
根据大肠杆菌代谢路径分析，为促进丁二胺合成，研究聚焦于表达 gdhA、argB、argC、argD、argJ\ 和 ODC10 六个基因。其中 argJ\ 是经过密码子优化的谷氨酸棒杆菌来源基因，ODC10 为筛选获得的异源基因。
单基因过表达菌株的丁二胺产量评估
研究构建了 pRSM3-gdhA、pRSM3-argCB、pRSM3-argD、pRSM3-argJ\* 和 pRSM3-ODC10 质粒（图3-2a），并转入底盘菌株进行单基因过表达测试。
研究结果
单基因过表达的效果差异
单基因过表达实验中，各基因对丁二胺产量的影响呈现明显差异。过表达 gdhA 的菌株丁二胺产量为0.4 g/L，过表达 argCB 的菌株产量为0.5 g/L，过表达 argD 的菌株产量为0.6 g/L，过表达 argJ\** 的菌株产量为0.5 g/L，而过表达 ODC10 的菌株产量达到0.9 g/L。其中 ODC10* 单基因过表达的效果最为突出，较对照组提升了约80%。这一结果表明，鸟氨酸脱羧酶可能是丁二胺合成路径中的关键限速步骤。
多基因组合过表达的协同效应
基于单基因筛选结果，研究进一步构建了多基因组合过表达菌株。将 gdhA、argB、argC、argD、argJ\** 和 ODC10* 进行不同组合的串联表达，测试其对丁二胺产量的协同影响。
组合过表达 argD 与 ODC10 的菌株，丁二胺产量达到1.2 g/L。在 argD 和 ODC10 基础上继续引入 argJ\，产量进一步提升至1.5 g/L。而将 gdhA、argB、argC、argD、argJ\ 和 ODC10 全部串联过表达的菌株，丁二胺产量达到1.8 g/L。
α-酮戊二酸供给模块的强化
在优化丁二胺生产模块的基础上，研究对 α-酮戊二酸供给模块进行了系统强化。该模块涉及TCA循环中柠檬酸向 α-酮戊二酸的转化路径，研究通过过表达 citZ、icd 和 gltA 等基因，增强 α-酮戊二酸的前体供给能力。
单独强化 α-酮戊二酸供给模块（过表达 gltA）的菌株，丁二胺产量为0.7 g/L。将 gltA 与 icd 共同过表达，产量提升至0.9 g/L。而在 α-酮戊二酸供给模块中同时过表达 citZ、icd 和 gltA，产量达到1.1 g/L。
双模块协同优化的最终效果
将优化后的丁二胺生产模块与 α-酮戊二酸供给模块进行组合，研究构建了同时强化两个模块的工程菌株。该菌株同时过表达丁二胺生产模块的 gdhA、argB、argC、argD、argJ\**、ODC10 以及 α-酮戊二酸供给模块的 citZ、icd、gltA*，共9个基因。
最终工程菌株的丁二胺产量达到2.1 g/L，较初始对照菌株提升至2.1 g/L。值得注意的是，双模块协同强化菌株的产量高于任一模块单独强化的菌株，表明两个模块之间存在正向的协同效应。α-酮戊二酸供给模块的强化为丁二胺生产模块提供了更充足的前体，而丁二胺生产模块的强化则加速了前体向产物的转化，两者共同作用推动了整体通量的提升。
模块化策略的优势
该研究采用的模块化代谢工程策略，将复杂的代谢网络拆解为相对独立的功能模块，分别进行优化后再进行系统整合。这种策略的优势在于：一方面，单基因过表达筛选能够快速识别限速步骤；另一方面，模块间的组合优化可以在保持代谢平衡的前提下实现通量的逐步提升。
研究还利用了同四聚体酶切位点（Bln I、Xba I、Nhe I、Spe I）构建多基因串联表达系统。这四个限制性内切酶产生相同的CTAG粘性末端，使得多个基因可以按预定顺序高效串联，避免了传统多基因共表达中常见的载体构建困难问题。
讨论与展望
本研究通过模块化代谢工程策略，将大肠杆菌丁二胺合成路径系统拆解为产物合成与 α-酮戊二酸供给两个模块，通过逐级优化与组合，最终实现丁二胺产量2.1 g/L。这一产量水平与文献报道的同类工程菌株相比具有竞争力，验证了模块化策略在复杂代谢网络改造中的有效性。
值得注意的是，ODC10 单基因过表达即带来显著产量提升，提示鸟氨酸脱羧酶在大肠杆菌丁二胺合成中扮演限速角色。而 α-酮戊二酸供给模块的强化效果相对温和，说明TCA循环的通量弹性可能限制了前体供给的进一步提升。未来研究可考虑动态调控策略——例如利用代谢传感器实时调节模块基因表达——以进一步优化两个模块之间的通量配比。此外，发酵条件的系统优化（如pH控制、溶氧调节、诱导时机）也可能在现有菌株基础上进一步提升产量。原文摘要未详述发酵参数与放大实验，这些方向有待后续研究填补。
参考来源
Sun X, Li Z, Sun Y, Li D, Zhao K. Enhancement and balance of 1,4-butanediamine biosynthesis in Escherichia coli based on modular metabolic engineering. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. PMCID: PMC13449784.
PMCID: PMC13449784