来源：RSC Chem Biol | 编译：DNA Lab Space
谷氨酰胺是生物体内功能最丰富的氨基酸之一，其代谢紊乱与肿瘤发生、神经退行性疾病和免疫失调密切相关。然而，传统代谢检测方法难以实现活细胞中谷氨酰胺的实时、高时空分辨监测。本研究开发了一种基于细菌谷氨酰胺结合蛋白的高灵敏度基因编码荧光生物传感器，首次实现了在哺乳动物活细胞中可视化谷氨酰胺浓度的空间分布和动态变化，为代谢研究提供了全新的分子工具。
研究背景
谷氨酰胺作为血液中含量最高的游离氨基酸，不仅是蛋白质合成的原材料，更是细胞能量代谢、核苷酸合成和氧化还原平衡的关键枢纽。在快速增殖的肿瘤细胞中，谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶介导的分解代谢回补三羧酸循环中间体，维持线粒体功能并为大分子合成提供碳源和氮源。这种对谷氨酰胺的“成瘾性”使得谷氨酰胺代谢成为癌症诊疗的重要靶点。此外，谷氨酰胺在神经系统中充当兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性递质γ-氨基丁酸的前体，参与突触传递和神经元保护等多种生理过程。
长期以来，研究人员依赖放射性同位素标记、液相色谱-质谱联用或毛细管电泳等离体检测手段来追踪谷氨酰胺代谢。这些方法虽然灵敏度和精确度高，但需要破坏细胞和組織结构，无法回答谷氨酰胺在亚细胞区室中如何分布、浓度如何实时波动、以及不同生理状态下代谢流向如何改变等核心问题。近年来，基因编码荧光生物传感器的概念逐渐成熟——将代谢物结合蛋白与荧光蛋白融合，通过构象变化实现目标代谢物的实时光学成像。然而，已有的谷氨酰胺传感器或因响应幅度小、荧光动态范围窄，或因亲和力与生理浓度范围不匹配，应用受到很大限制。因此，开发一种具备优异灵敏度和宽广动态范围的谷氨酰胺传感器，对于推进代谢空间生物学研究具有重要意义。
研究方法
研究团队选取大肠杆菌周质空间中的谷氨酰胺结合蛋白GlnH作为传感器骨架。GlnH具有经典的II型周质结合蛋白折叠结构，由两个结构域通过铰链区连接，当结合谷氨酰胺时发生“开-闭”构象变化。为实现这一构象变化向光学信号的转换，研究人员将该蛋白与循环排列的绿色荧光蛋白（cpGFP）进行基因融合，使GlnH的构象变化能够直接改变cpGFP发色团周围的化学微环境，从而产生荧光强度的响应。
在研究流程上，团队首先通过结构比对和序列分析，确定了GlnH上适合插入cpGFP的柔性环区域，并设计了多个融合位点的候选变体。随后利用定点突变技术对配体结合口袋周边的氨基酸残基进行系统突变，旨在调节传感器与谷氨酰胺的结合亲和力，使之覆盖哺乳动物细胞内的生理浓度范围。每一个候选变体都在大肠杆菌中进行可溶性表达和纯化，并通过荧光分光光度计进行体外功能筛选，以检测加入谷氨酰胺前后的荧光强度变化比例。经过多轮筛选与迭代优化，研究团队最终获得了一个在灵敏度和响应速度上都表现最佳的变体。
为验证传感器的实用性，研究者将其克隆至哺乳动物表达载体，通过脂质体转染导入HeLa细胞。借助共聚焦荧光显微镜，实时记录细胞在添加外源谷氨酰胺、谷氨酰胺酶抑制剂以及谷氨酰胺转运体抑制剂条件下的荧光变化；同时，利用荧光信号的空间分布特征，分析谷氨酰胺在细胞不同区域（如细胞核周围、细胞边缘、胞质深部）的浓度差异，以绘制亚细胞尺度的谷氨酰胺代谢图谱。
研究结果
新构建的基因编码谷氨酰胺生物传感器在体外纯化实验中表现出显著的光学响应。研究团队从多个插入位点和突变组合中筛选出的最优变体，在饱和谷氨酰胺浓度下荧光强度变化较基础状态有明显提升，表明传感器在构象转导效率上实现了较以往报道的优化。剂量-反应曲线显示，传感器的解离常数落在数十微摩尔水平，与哺乳动物细胞内外谷氨酰胺的生理浓度高度匹配，这使得传感器既能感应静息状态下较低的胞内谷氨酰胺浓度，也能捕捉代谢活跃时浓度的快速攀升。
在选择性测试中，该传感器对谷氨酰胺表现出高度专一性——加入化学结构类似的天冬酰胺、组氨酸、谷氨酸或丙氨酸均未引起显著荧光变化，证实了GlnH结合口袋对谷氨酰胺的严格识别特异性。此外，传感器对pH的依赖性在生理pH范围内保持稳定，排除了细胞微环境酸碱波动造成伪影的干扰。
在HeLa活细胞成像实验中，向培养基中添加外源性谷氨酰胺后，传感器荧光信号在数分钟内迅速上升，并呈现剂量依赖性。随之使用谷氨酰胺酶抑制剂DON处理细胞，荧光信号显著回落，表明传感器能够忠实反映谷氨酰胺被代谢消耗的动态过程。更为有趣的是，研究人员通过高分辨率空间成像发现，谷氨酰胺在细胞内的分布并非均匀的——细胞核周区域显示出较高的荧光强度，而细胞膜边缘区域则相对较低；这种空间异质性在添加代谢抑制物后进一步加剧，提示线粒体代谢活跃区可能形成了局部的谷氨酰胺消耗热点或转运富集区域。
此项研究成果的亮点在于，谷氨酰胺的空间分布成像首次在活细胞中揭示了代谢物浓度的亚细胞地理学特征——不同细胞器周边的代谢物浓度洼地与富集区共存，这些精细的浓度梯度信息是传统代谢组学方法无法捕捉的。该发现为理解“代谢区室化”提供了直接的可视化证据，也表明谷氨酰胺代谢并非均匀混合的生化过程，而是高度受空间组织和转运调控的稳态网络。
讨论与展望
该研究开发的灵敏基因编码生物传感器，为谷氨酰胺代谢的空间动态研究提供了全新的光学窗口。相比传统方法，这种传感器在维持细胞完整性的前提下，以秒级至分钟级的时间分辨率连续监测代谢物浓度变化，并将信息精确锚定到亚细胞结构和特定细胞类型。这在方法学上是一次重要突破，有望推动代谢生物学从“匀浆分析”走向“空间可视化”的范式转变。
这一工具的潜在应用范围十分广阔。在肿瘤生物学中，借助该传感器可实时追踪癌细胞在三维培养或类器官模型中的谷氨酰胺摄取与消耗动态，评估谷氨酰胺酶抑制剂等靶向药物的疗效；在神经科学中，可以监测突触活动时谷氨酰胺-谷氨酸循环的昼夜节律与活性依赖动态；在免疫代谢领域，则可观察淋巴细胞活化过程中的代谢重编程。未来，若将该传感器与其他代谢物探针（如葡萄糖、ATP、乳酸传感器）联合使用，并通过多色成像实现多参数同步检测，将有望构建一幅更加完整的“代谢空间地图”。此外，开发适用于活体动物成像的近红外或红移荧光变体，并建立转基因小鼠模型，也将是该传感器向临床前和临床研究延伸的重要方向。
参考来源
Scully JM, Sun MJ, Das S, Arias NJ, Kapelczak ED. Illuminating spatial dynamics of glutamine metabolism with a sensitive genetically encoded biosensor. RSC Chem Biol. DOI: 10.1039/D4CB00129B