来源：Protein Sci | 编译：DNA Lab Space
细菌群体感应（quorum sensing, QS）系统是许多病原微生物调控毒力因子表达和生物膜形成的关键机制，而内酯酶能够不可逆地水解群体感应信号分子——N-酰基高丝氨酸内酯（AHL），从而“淬灭”细菌通讯，因此被认为是极具潜力的抗菌策略。然而，天然来源的内酯酶普遍存在稳定性差、催化效率低等问题，严重制约其实际应用。本研究从植物内生真菌 Aspergillus pseudonomiae 中分离并表征了一种新型内酯酶，该酶不仅具有优异的体外稳定性，还展现出广谱的细菌和真菌抑制活性，为抗生素替代品开发及绿色生物防治提供了全新候选分子。
研究背景
群体感应是细菌通过分泌和感知信号分子进行细胞间通讯的一种密度依赖性行为。革兰氏阴性菌最常用的信号分子是AHL分子，其结构由一个高丝氨酸内酯环和一条可变长度的酰基侧链组成。当AHL浓度达到阈值后，其与转录调节因子结合，激活一系列下游基因表达，包括毒力因子分泌、生物膜形成、抗生素耐药和色素产生等。因此，通过降解AHL来阻断群体感应通路，已成为一种不直接抑制细菌生长的抗毒力策略，理论上可有效降低病原菌耐药性选择压力。
内酯酶（lactonase）属于金属水解酶家族，能够特异性打开AHL的内酯环，使其失去信号活性。目前已知的内酯酶主要来源于芽孢杆菌、土壤农杆菌等原核生物，但普遍存在热稳定性差、对氧化还原环境敏感等问题，难以适应实际应用场景。真菌内生菌因与宿主植物长期协同进化，常能产生具有独特性质的水解酶类，是新型酶资源的重要宝库。然而，关于真菌来源内酯酶的鉴定及生物学功能研究仍十分有限。本研究聚焦于内生真菌 A. pseudonomiae 中的一种新内酯酶，试图揭示其分子特征、稳定性和抗菌抗真菌功能，为后续药物开发和工程改造奠定基础。
研究方法
研究者首先从 A. pseudonomiae 菌株中通过基因组分析和序列比对锁定了一个推测的内酯酶编码基因，随后将其克隆至原核表达载体，并在 E. coli 中进行异源表达。利用镍亲和层析和凝胶过滤层析对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE和蛋白质质谱验证其纯度和分子量。
为表征该酶的生物学功能，研究者合成了一系列不同链长的AHL类似物及对硝基苯酚内酯底物，用于测定其水解活性。通过紫外-可见分光光度法跟踪反应产物在特定波长的吸收变化，计算酶动力学参数（\(K_m\)、\(k_{cat}\)），并进一步考察了pH、温度、金属离子及化学试剂对酶活性的影响。稳定性评估包括热稳定性（在不同温度下孵育后测定残余活性）、pH稳定性和长期储存稳定性。
在抗菌和抗真菌活性测试中，研究者采用圆盘扩散法和最小抑菌浓度（MIC）法，选取多种革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）、革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、铜绿假单胞菌）以及常见的病原真菌（如白色念珠菌、尖孢镰刀菌）作为指示菌。同时设置不添加酶或添加热失活酶的对照组，以排除非特异性杀菌作用的干扰。此外，还通过荧光显微镜和流式细胞术初步探究了该酶对病原菌细胞膜完整性的影响。
研究结果
成功表达纯化出分子量约38 kDa的可溶性重组蛋白，质谱鉴定结果与预测序列一致。酶学性质分析显示，该内酯酶对中长链AHL底物表现出最强的亲和力，\(K_m\)值处于微摩尔范围内，表明其在生理浓度下即可高效降解群体感应信号分子。催化活性依赖于二价金属离子（\(Zn^{2+}\)或\(Mn^{2+}\)），在去除金属离子后活性显著降低，符合金属内酯酶的典型特征。
稳定性测试结果令人关注：该酶在40°C至60°C范围内孵育1小时后仍保留80%以上活性，在70°C时仍能维持约50%的活性，显著优于许多已报道的细菌源内酯酶。在pH 6.0至10.0的宽泛区间内，该酶均表现出较高的稳定性和催化活性，尤其在中性和弱碱性环境中活性最高。此外，该酶对有机溶剂（如10% DMSO、甲醇、乙醇）和一定浓度的变性剂（如0.1% SDS）表现出良好耐受性。长期储存实验表明，在4°C条件下保存30天，酶活性无明显损失。
在抗菌活性方面，该内酯酶对受试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均显示出不同程度的抑制作用，其中对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最为显著，MIC值低于同源内酯酶对照。值得注意的是，与常规抗生素不同，该酶并不直接杀死细菌，而是通过降解AHL信号分子降低毒力因子产生和生物膜形成，因此细菌不易对其产生耐药性。在真菌抑制实验中，该酶在100 μg/mL浓度下能够有效抑制白色念珠菌和植物病原真菌尖孢镰刀菌的菌丝生长，表现出潜在的抗真菌活性。进一步的机制实验表明，该酶可能通过干扰真菌细胞膜完整性或破坏其代谢过程来实现抑制效果，具体机制尚待深入解析。
讨论与展望
本研究报道的内生真菌来源内酯酶具有显著的热稳定性和广谱抗菌抗真菌活性，这在目前已报道的内酯酶中较为罕见。其稳定的分子架构可能与其真菌宿主所处的复杂微环境密切相关，这种进化适应性使得该酶天然具备良好的抗逆能力，为其产业化应用提供了先天优势。该酶既能降解细菌群体感应信号分子以抑制细菌致病性，又能直接抑制真菌生长，这种双重活性使其在医学抗菌敷料、食品安全防腐、作物病害防治等领域具有广阔的应用前景。然而，目前尚不清楚该酶对真菌的抑制是否依赖于内酯水解活性，还是存在其他独立的效应机制。未来可通过定点突变和晶体结构解析，精确定位其催化活性位点和抗菌功能域，从而指导分子改造以进一步提升活性和稳定性。此外，体内安全性评价和动物感染模型实验也是推动其走向临床或农业应用的必要环节。该研究不仅扩大了对真菌源内酯酶的认识，也为开发新型抗感染生物制剂提供了极具价值的先导分子。
参考来源
Ben Tovim D, Trofimyuk O, Yariv E, Prag G, Afriat-Jurnou L. The characterization of a new stabilized lactonase from the endophytic fungi Aspergillus pseudonomiae with anti-bacterial and anti-fungal properties. Protein Science. DOI: 未提供（原文未标注DOI）.