绞股蓝皂苷生物合成后修饰阶段CYP与UGT基因挖掘及表达分析

来源：PLoS One | 编译：DNA Lab Space

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绞股蓝皂苷作为天然活性成分，其生物合成途径中的细胞色素P450（CYP）和UDP-糖基转移酶（UGT）催化的后修饰反应是结构多样性的关键。本研究整合RNA测序与蛋白质组测序数据，系统挖掘绞股蓝中参与皂苷后修饰的CYP和UGT基因，并通过表达谱分析揭示其潜在功能，为解析绞股蓝皂苷生物合成调控机制及代谢工程改造提供了重要基因资源。

研究背景

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino）是葫芦科多年生草质藤本植物，其叶片中富含达玛烷型四环三萜皂苷，与人参皂苷具有相似骨架，因而被誉为“南方人参”。绞股蓝皂苷具有抗肿瘤、降血脂、保肝、免疫调节等多种药理活性，具有重要的药用和经济价值。然而，绞股蓝皂苷天然含量低、结构类似物众多，严重制约了其规模化应用。通过合成生物学手段实现异源高效合成，是解决资源瓶颈的重要途径，而这有赖于对皂苷生物合成途径的全面解析。

三萜皂苷的生物合成可分为三个阶段：上游甲羟戊酸/脱氧木酮糖磷酸途径提供异戊二烯单元；中游通过鲨烯合酶、鲨烯环氧酶和达玛烯二醇合酶催化形成三萜骨架；下游则是一系列后修饰反应，包括细胞色素P450介导的氧化反应和UDP-糖基转移酶催化的糖基化反应。其中，CYP和UGT是决定皂苷母核氧化位点和糖链组成的关键酶，其催化产物直接影响最终皂苷结构的多样性和生物活性。尽管模式植物中三萜皂苷后修饰基因已有较多报道，但绞股蓝中负责达玛烷型皂苷多样化的CYP和UGT家族基因仍缺乏系统性鉴定和功能验证。

近年来，随着高通量测序技术的发展，转录组测序已广泛应用于药用植物功能基因挖掘，但单纯基于mRNA水平筛选往往难以准确反映蛋白丰度及酶活性。蛋白质组测序能够提供翻译水平的直接证据，将二者联合分析可以有效提高关键候选基因的筛选置信度。本研究即采用RNA-seq与蛋白质组测序相结合的策略，对绞股蓝不同组织（或不同发育时期）中CYP和UGT基因进行全面挖掘与表达分析，旨在揭示参与皂苷后修饰的关键酶基因，为后续功能研究和合成生物学应用奠定基础。

研究方法

研究选用适宜的绞股蓝材料，分别提取总RNA和总蛋白，进行转录组测序（RNA-seq）和基于串联质谱标签（TMT）的定量蛋白质组学分析。RNA-seq部分，构建cDNA文库后在Illumina平台进行双端测序，原始读段经质控、过滤后拼接为转录本，并与参考基因组或从头组装的转录组比对，获得基因表达量。蛋白质组部分，蛋白样品经酶解、TMT标记后，通过高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定和定量蛋白质。随后，利用生物信息学方法对两组数据进行整合分析。

首先，从转录组和蛋白质组的注释结果中分别提取CYP和UGT家族成员，依据Pfam结构域和拟南芥等物种的已知序列进行同源比对，确认候选基因的完整性。其次，计算转录组表达量（FPKM/TPM）和蛋白质丰度（蛋白比值），筛选在特定组织或处理条件下显著差异表达的CYP/UGT基因。设定双重筛选阈值：mRNA表达差异倍数≥2且蛋白丰度差异倍数≥1.5，并通过统计检验（如P值<0.05）控制假阳性率。同时，对于转录组和蛋白质组变化趋势一致的基因，标记为高置信候选基因。进一步，对候选基因进行序列特征分析，包括开放阅读框预测、保守功能域注释、跨膜区分析和系统进化树构建。通过与其他物种中已知功能的三萜皂苷相关CYP和UGT聚类，推测候选基因可能的催化类型（如羟基化、糖基化）。此外，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对部分候选基因在不同组织中的mRNA表达水平进行验证，并与皂苷含量测定结果关联分析，以评估其表达模式与皂苷积累的相关性。

技术流程概览：RNA-seq与蛋白质组测序联合分析挖掘CYP/UGT候选基因，并通过qRT-PCR和系统发育分析进行验证。

研究结果

通过综合转录组和蛋白质组测序数据，研究共鉴定出大量CYP和UGT家族转录本和蛋白。质谱鉴定到的蛋白中，CYP和UGT家族成员覆盖了主要亚家族，表明绞股蓝中这两类酶在蛋白水平上广泛表达，并可能参与多种次级代谢过程。差异表达分析显示，在不同组织（如叶、茎、根）或不同发育时期中，相当数量的CYP和UGT基因表现出显著的丰度变化，提示其表达具有组织特异性和发育阶段依赖性。

通过联合筛选，研究重点锁定了一批在转录组和蛋白质组中均呈现相同趋势的候选基因。其中，若干CYP基因在叶片中高表达，并且其表达趋势与叶片中皂苷含量的积累呈正相关。这些CYP基因编码蛋白的系统进化分析显示，它们与已知参与三萜皂苷C-20位或C-2位羟基化的CYP716A家族成员聚在一起，因此推测它们可能参与达玛烷型皂苷母核的氧化修饰。另一类候选UGT基因则在根或叶中特异性高表达，其编码蛋白与已知糖基转移酶UGT73家族具有较高同源性，而该家族在多种植物中负责三萜皂苷的糖基化。基于序列保守性和分子对接预测，部分UGT可能优先以UDP-葡萄糖或UDP-木糖为糖供体，催化达玛烷型三萜不同位点的糖基化反应，从而形成绞股蓝皂苷中常见的葡萄糖基、木糖基侧链。

值得注意的是，研究还发现部分CYP和UGT基因在转录组和蛋白质组表达水平存在不一致的现象。例如，一些基因的mRNA丰度较高，但蛋白检测不到或丰度低；反之，个别蛋白丰度高但转录本丰度低。这一结果表明，绞股蓝中CYP和UGT的表达不仅受转录水平调控，还可能存在翻译或翻译后调控。通过联合多组学数据，这类模块被排除在优先候选之外，凸显了蛋白组验证的必要性。

进一步，qRT-PCR验证结果与转录组数据具有良好一致性。结合绞股蓝不同部位皂苷含量的测定，部分候选基因的表达水平与总皂苷或特定皂苷单体的含量显著正相关。例如，一个被命名为CYP-P5的基因在叶片中的转录水平较根中高约数十倍，同时叶片总皂苷含量也显著高于根，提示CYP-P5可能参与了叶片中优势皂苷元的后修饰。此外，研究还克隆了若干全长候选基因序列并进行生物信息学分析，证实其具有完整的细胞色素P450或糖基转移酶保守结构域，且亚细胞定位预测多为内质网或细胞质，与膜结合CYP和可溶性UGT的特性相符。

关键候选CYP和UGT基因在不同组织中的表达热图及与皂苷含量的相关性分析。

候选CYP/UGT蛋白与已知三萜皂苷修饰酶的系统进化关系，显示其所属亚家族及推测功能。

讨论与展望

本研究通过RNA-seq与蛋白质组测序的整合分析，系统挖掘了绞股蓝中与皂苷后修饰相关的CYP和UGT基因，并在表达层面提供了多组学证据。联合筛选策略有效克服了单一转录组数据假阳性高、蛋白水平证据不足的缺陷，为药用植物功能基因的发现提供了可借鉴的方法学参考。所获得的候选基因不仅扩展了绞股蓝中CYP和UGT家族的成员信息，也为后续通过异源表达和体外酶活实验验证其具体催化功能奠定了基础。

然而，本研究仍以生物信息学预测和表达关联分析为主，尚缺乏直接的酶催化功能证据。未来应着重对高置信候选基因进行酵母或烟草瞬时表达系统的功能验证，明确其催化底物、产物及糖供体选择性。同时，鉴于绞股蓝皂苷结构复杂，单基因功能研究往往难以完整重建后修饰途径，可考虑通过多基因共表达、合成生物学途径重构等手段，在异源宿主中实现绞股蓝皂苷的全链条生物合成。此外，转录因子对CYP和UGT基因的协同调控，以及环境因子对后修饰步骤的影响，也是值得深入探索的方向。随着基因组编辑和定向进化技术的发展，利用本研究挖掘的基因资源定向改造绞股蓝皂苷组成，将有望实现高活性稀有皂苷的绿色制造，推动绞股蓝药用价值的高效开发。

参考来源

Zhang Y, Chen Q, Huang Y, Zhao R, Sun J. Gene excavation and expression analysis of CYP and UGT related to the post modifying stage of gypenoside biosynthesis in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by comprehensive analysis of RNA and proteome sequencing. PLoS One. DOI: 未标注.