来源：Fungal Biol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
CRISPR/Cas9技术已广泛应用于多种生物的基因组编辑，然而在丝状真菌尤其是食品工业菌株中的应用仍面临外源DNA整合和转化效率低等瓶颈。本研究以Quorn蛋白生产菌株Fusarium venenatum A3/5为对象，通过瞬时表达Cas9蛋白和靶向内源聚酮合酶基因PKS12的sgRNA，成功实现了无需外源DNA整合的基因编辑，并利用白化表型作为直观筛选标记验证编辑事件。该策略不仅为这一重要食用真菌提供了高效的遗传操作工具，也为其作为"无转基因"食品级工业菌株的合规应用开辟了新途径。
研究背景
Fusarium venenatum A3/5是商业化替代蛋白产品Quorn的主要生产菌株，自上世纪八十年代起被广泛用于真菌蛋白的工业化生产。作为一种食用安全级（GRAS）丝状真菌，其遗传背景清晰、发酵工艺成熟，然而长期以来缺乏高效的基因编辑工具，限制了菌株改良和代谢工程研究。传统农杆菌介导转化或随机插入突变等方法往往导致外源DNA随机整合进基因组，这不仅影响遗传稳定性，也带来潜在的食品安全和法规监管问题。
CRISPR/Cas9系统凭借其精准、高效的操作特性，已在曲霉、木霉等多种丝状真菌中实现基因编辑。但在F. venenatum中，Cas9蛋白和sgRNA的稳定表达需要将外源表达框整合至基因组，这不可避免地产生转基因标记。如何在完成编辑的同时避免外源DNA残留，是该菌株遗传改良面临的核心技术挑战。PKS12基因编码聚酮合酶，负责F. venenatum孢子色素（橘红色素）的生物合成。一旦该基因被破坏，菌落即呈现明显的白化表型，这种肉眼可辨的变化为基因编辑事件的筛选提供了理想的内源视觉标记。
研究方法
研究团队设计了一套基于瞬时表达CRISPR/Cas9系统的编辑策略。首先，研究人员针对PKS12基因的保守功能域设计了两条独立的sgRNA，分别定位于该基因编码区的不同位点，以最大化切割效率和突变引入概率。sgRNA的靶点选择遵循严格的特异性评估，确保目的基因被有效编辑的同时降低脱靶效应。
在表达载体构建方面，研究采用了一个关键的策略：将酿酒酵母来源的Cas9编码序列置于真菌组成型强启动子控制之下，两条sgRNA则由RNA聚合酶III启动子驱动，三者共同装配于一个自主复制载体上。该载体不携带真菌基因组整合所必需的同源臂序列，仅依靠游离型复制元件维持其在转化初期的瞬时存在。
原生质体转化是本研究的技术核心。研究人员通过酶解法去除F. venenatum菌丝细胞壁制备原生质体，随后采用聚乙二醇（PEG）介导的方法将上述CRISPR/Cas9载体导入原生质体。在转化后的再生培养过程中，借助选择压力筛选阳性转化子，但值得注意的是，由于载体上不含有筛选标记基因，阳性转化子的识别完全依赖于对PKS12基因编辑后产生的白化表型进行直接观察。
对再生菌落进行表型筛选后，研究者收集白化菌落提取基因组DNA，通过PCR扩增PKS12靶位点两侧的序列片段，利用Sanger测序并结合T7核酸内切酶I酶切分析，从分子水平核查突变位点及突变类型。为验证瞬时表达策略是否真正避免外源DNA整合，研究人员还对转化子基因组进行了更深入的分子检测，包括是否存在Cas9编码序列或载体骨架残留，以此确认基因组中不含有来自CRISPR系统的任何外源片段。
研究结果
研究结果显示，在PEG介导的原生质体转化实验中，携带CRISPR/Cas9载体的实验组在再生平板上出现了多个白化菌落，而空载体对照组中则未观察到类似表型。白化菌落的出现频率约为每个平板2-5个转化子，体现出该系统在F. venenatum中具有可操作的编辑效率。
对白化菌落靶位点的PCR扩增和测序分析证实，PKS12基因确实发生了突变。测序结果显示，这些突变以小片段插入或缺失（indels）为主。有趣的是，在部分白化菌株中检测到基因片段缺失发生在两个sgRNA识别位点之间，这一结果提示两个靶位点的同时切割可导致基因组DNA大片段缺失，从而更彻底地失活了PKS12基因功能。
T7核酸内切酶I酶切实验进一步确认了靶向位点的异源双链DNA错配，从分子层面验证了编辑事件的真实性。在获得的白化转化子中，研究者从基因组水平追踪Cas9和sgRNA表达盒的整合情况。在所有检测的白化菌株中，均未扩增出Cas9编码序列或其载体骨架片段，表明在编辑完成后，CRISPR组件已随着瞬时载体的丢失而彻底清除。这种"打了就走"（hit-and-run）的编辑模式，成功避免了外源DNA在宿主基因组中的残留。
表型稳定性分析表明，将白化菌株连续传代五次后，其白化表型依然稳定维持，未出现表型回复或色素再合成现象。这一结果进一步证实PKS12基因的功能已发生不可逆的遗传改变，突变事件在基因组层面稳定遗传。值得注意的是，白化菌株的菌丝生长速率和生物量积累与野生型相比无显著差异，表明PKS12基因的失活并未对菌株的基础生理代谢造成不利影响。
讨论与展望
本研究报道的基于瞬时表达CRISPR/Cas9系统的策略为F. venenatum A3/5的基因组编辑提供了一种简洁高效的技术方案。与依赖外源标记基因稳定整合的传统编辑方法相比，该系统利用自主复制载体实现Cas9和sgRNA的瞬时表达，在有限的时间窗口内完成定点切割后即从菌株中自然丢失，从而确保最终获得的编辑菌株基因组中不含任何转基因痕迹。这一特性对于食品级工业菌株而言具有重要价值——在大多数国家和地区，不含外源DNA的编辑菌株在法规层面可被视作非转基因生物，从源头上规避了监管审批和市场准入的障碍。
以PKS12基因敲除为范例，本研究验证了内源代谢产物合成基因作为筛选标记的可行性。这种利用表型变化代替抗生素抗性筛选的策略，一方面消除了对选择性药物的依赖，另一方面也避免了为引入筛选标记而对菌株基因组进行额外修饰。从工业应用角度出发，PKS12基因的破坏不仅提供了可视化筛选报告系统，其白化表型本身也可能为后续菌株改良提供新的表型基础。
当然，该技术方案仍存在一定局限。自主复制载体在部分子代细胞中的丢失效率尚不完全可控，可能导致编辑效率的批次间差异。此外，本研究目前仅以营养缺陷型菌株为编辑对象，该策略能否运用于生产性能更优良的多倍体或异核体菌株仍有待验证。未来若能将同源修复模板引入该瞬时表达系统，有望实现精确的基因插入或碱基替换，从而进一步拓展这一食品级丝状真菌遗传改良的工具箱。
参考来源
Wilson FM, Harrison RJ. CRISPR/Cas9 mediated editing of the Quorn fungus Fusarium venenatum A3/5 by transient expression of Cas9 and sgRNAs targeting endogenous marker gene PKS12. Fungal Biology and Biotechnology. DOI: 待补充。