来源：Synth Syst Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
全球气候变化日益严峻，CO₂减排与资源化利用成为亟需解决的科学命题。利用碳酸酐酶（Carbonic anhydrase, CA）催化CO₂水合生成碳酸根离子，进而与钙离子结合形成碳酸钙沉淀，是实现CO₂高效固定与矿化的绿色生物技术路径。然而，游离CA酶在工业应用中面临稳定性差、回收困难等高成本瓶颈。近期，Zhu等人在Synthetic and Systems Biotechnology期刊发表了一项创新研究，利用冰核蛋白（INPN）将源自Sulfurihydrogenibium yellowstonense的耐热碳酸酐酶（StyCA）展示于大肠杆菌细胞表面，构建了一种无需细胞裂解、可重复利用、稳定性优异的全细胞生物催化剂，为CO₂捕获与生物矿化提供了高效、低成本的替代方案。该策略巧妙结合了耐热酶的优异催化性能和冰核蛋白的表面锚定能力，开辟了“膜展示催化”用于碳固定的新路径。
研究背景
CO₂捕获与封存（Carbon Capture and Storage, CCS）是实现碳中和目标的关键技术之一，但传统化学吸收法存在能耗高、溶剂易降解、二次污染等缺陷。生物酶法利用碳酸酐酶催化CO₂的水合反应（CO₂ + H₂O ⇌ HCO₃⁻ + H⁺），在温和条件下高效捕集CO₂，被视为极具潜力的绿色替代方案。然而，碳酸酐酶的工业应用长期受制于两大难题：其一，游离酶稳定性差，在严苛工业条件（高温、高盐、极端pH）下易失活；其二，游离酶难以从反应体系中回收，导致运行成本高企。针对上述瓶颈，研究者尝试将CA固定于载体表面或嵌入聚合基质，但这些方法往往导致酶活性显著下降或传质阻力增加。在此背景下，利用微生物细胞表面展示技术，将CA锚定于细胞外膜上，既能保留酶的高活性构象，又赋予全细胞催化剂可沉降、可回收的便利性。此外，细胞表面展示的拥挤微环境可模拟酶在生物膜中的自然状态，有助于维持酶的空间结构与活性。然而，此前表面展示CA系统多以E. coli外膜蛋白OmpA、冰核蛋白INP等为锚定基元，但普遍存在表达效率低、展示效率差、酶活性损失大等不足。因此，开发兼具高热稳定性与表面展示效率的CA展示系统，具有重要的学术价值与应用前景。
研究方法
在该研究中，研究者构建了基于冰核蛋白N-端结构域（INPN）与耐热碳酸酐酶StyCA融合表达的大肠杆菌表面展示系统。具体技术路线如下：
首先，从超耐热菌Sulfurihydrogenibium yellowstonense中克隆编码碳酸酐酶的StyCA基因，并通过PCR扩增。该酶属于β型CA，其最适温度高达80°C以上，在常温至高温区间均表现出优异催化活性。为实现在革兰氏阴性菌表面的锚定，研究者选用Pseudomonas syringae冰核蛋白的N-端运锚定结构域（INPN，1-240氨基酸），将其作为膜锚定基元。通过柔性接头（linker）将INPN与StyCA融合，构建重组质粒pET-INPN-StyCA。随后将质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达（示意图见
为验证融合蛋白是否成功定位于细胞表面，研究者采用多种互补手段：通过SDS-PAGE和Western blotting分析全细胞裂解物中的融合蛋白表达水平；利用蛋白酶K（proteinase K）处理完整细胞，若融合蛋白位于外表面，其胞外结构域将被降解，以此验证表面暴露程度；同时采用免疫荧光显微镜和流式细胞术，利用荧光标记抗体特异性识别StyCA标签，直观观察表面展示情况。此外，研究还测定了表面展示菌株的碳酸酐酶活性，采用对硝基苯酚乙酸酯（p-NPA）法检测酯酶活性，以及用pH下降速率法检测CO₂水合活性。为进一步评估其工业应用潜力，研究者考察了全细胞催化剂在反复冻融、高温孵育、重复离心回收后的活性保持率。最后，在含CaCl₂的溶液中通入CO₂或加入NaHCO₃，通过测定反应体系中碳酸钙沉淀的生成量（重量法和扫描电镜SEM表征），评价该全细胞催化剂驱动CO₂矿化的整体效率。
研究结果
结果显示，构建的INPN-StyCA融合蛋白在大肠杆菌中成功表达，并通过冰核蛋白N-端结构域锚定在细胞外膜上。蛋白酶K处理实验证实，StyCA结构域暴露于细胞表面，可被蛋白酶K降解，而对照菌株无此现象。免疫荧光显微镜和流式细胞术进一步证实荧光信号主要分布于细胞表面，体现了清晰的细胞表面定位。此外，该展示菌株的生长曲线与野生型菌株无明显差异，表明表面展示未对细胞正常增殖造成显著负担。
在催化性能方面，表面展示菌株表现出可观的碳酸酐酶活性，其p-NPA酯酶活性约为12.3 U/mg细胞干重，CO₂水合活性约为1.4×10³ WAU/mg细胞干重。尤为重要的是，耐热性评估表明，该菌株在50°C处理1小时后仍保留80%以上的初始活性，在70°C处理30分钟后活性保持率仍超过50%，远优于此前报道的基于OmpA等锚定蛋白的展示系统。此外，经过10次反复冻融循环和5次离心回收循环，全细胞催化剂的活性保持率分别高达65%和85%，展现出优异的操作稳定性。相比于游离胞内表达的StyCA酶，表面展示形式并未导致催化效率下降，表明INPN锚定基元对酶活性中心的干扰极小。值得注意的是，将表面展示菌株加入到CaCl₂溶液中并持续通入CO₂后，反应体系10分钟内即出现肉眼可见的白色沉淀。SEM观察显示，沉淀呈典型的方解石晶型，推断为碳酸钙结晶。反应30分钟后，体系中的CO₂固定量可达1.78 g/g细胞干重。对照组（不表达StyCA的空载体菌株）仅产生极少量沉淀，说明沉淀的形成确实由表面展示的CA催化CO₂水合所驱动。这些结果有力证明了该表面展示系统可将溶解的CO₂快速转化为碳酸根，并通过与钙离子的沉淀反应实现固相矿化，达到碳捕获与封存的目的（关键数据见和
讨论与展望
本研究开发了一种基于冰核蛋白锚定的大肠杆菌表面展示系统，成功将耐热碳酸酐酶以高活性的形式固定在细胞外表面，实现了全细胞水平的CO₂催化水合与矿化。这一策略巧妙整合了超耐热酶的广泛温度适应性与细胞表面展示的易于回收、高度稳定性等优点，解决了游离酶应用中长期存在的瓶颈。与传统载体固定化方法相比，表面展示技术无需昂贵的纯化和化学交联步骤，大大简化了催化剂制备流程，降低了成本。然而，该系统的实际应用还存在若干挑战。例如，细胞外膜展示对外源蛋白的表达量有一定上限，过量表达可能导致细胞生长抑制或外膜完整性受损。此外，全细胞催化剂在连续流动反应器中的长期运行寿命仍需系统评价。未来的改进方向可能包括：利用合成生物学方法进行启动子工程与核糖体结合位点优化，提高展示效率；定向进化StyCA以提高其在特定工况下的催化活性；开发可自裂解释放矿化产物的工程菌株；以及将表面展示CA与光驱固碳或电化学系统耦合，实现电能/光能驱动的CO₂转化。总体而言，该研究为基于微生物全细胞催化剂的C捕获与矿化技术提供了新的理论基础与可行路径，展示了合成生物学在双碳目标实现中的独特价值。
参考来源
Zhu Y, Liu Y, Ai M, Jia X. Surface display of carbonic anhydrase on Escherichia coli for CO₂ capture and mineralization. Synthetic and Systems Biotechnology, 2022. DOI: 10.1016/j.synbio.2022.05.001.