来源：Synth Syst Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导语
(-)-龙脑是名贵中药材艾纳香的主要药效成分，在医药、香料及食品领域应用广泛，但传统植物提取受资源与成本制约。本研究从艾纳香中克隆并鉴定了催化(-)-龙脑生物合成关键步骤的(-)-龙脑基二磷酸合酶（BbBPPS），并通过代谢工程在酿酒酵母中成功实现了(-)-龙脑的异源从头合成，为天然冰片的绿色生产提供了新途径。
研究背景
(-)-龙脑（又称左旋冰片）是一种双环单萜醇，具有开窍醒神、清热止痛等药理活性，是中药艾纳香（Blumea balsamifera）的特征性成分之一。目前工业上获取(-)-龙脑主要依赖从艾纳香叶片中提取或化学半合成，前者面临植物生长周期长、含量低、提取成本高等问题，后者则存在步骤繁琐、产物光学纯度不足及环境不友好等缺陷。利用合成生物学手段在微生物宿主中重构(-)-龙脑的生物合成途径，为实现其可持续供应提供了极具吸引力的替代方案。
在植物中，单萜化合物的生物合成通常由萜烯合酶催化：牻牛儿基二磷酸（GPP）在萜烯合酶的作用下，通过碳正离子级联反应环化生成龙脑基二磷酸（bornyl diphosphate, BPP），随后经磷酸酶水解释放龙脑。尽管已有少数植物来源的龙脑基二磷酸合酶被报道，但艾纳香中负责(-)-龙脑合成的关键酶尚未得到明确鉴定，且其在异源微生物宿主中的功能表达和途径整合仍缺乏系统研究。因此，挖掘艾纳香中特异性合成(-)-龙脑的酶基因，并将其应用于酿酒酵母进行异源生产，具有重要的科学意义和应用价值。
研究方法
该研究首先基于艾纳香转录组数据，筛选出多条可能编码萜烯合酶的候选基因序列，通过序列比对与系统发育分析，锁定了一条与已知龙脑基二磷酸合酶同源性较高的候选基因，命名为BbBPPS（Blumea balsamifera bornyl diphosphate synthase）。研究人员采用RT-PCR技术从艾纳香叶片cDNA中扩增获得该基因的完整开放阅读框，并构建至原核表达载体pET-32a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。通过Ni-NTA亲和层析纯化获得重组蛋白BbBPPS，在体外酶促反应体系中以牻牛儿基二磷酸（GPP）为底物，经气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析产物结构，验证该酶的催化功能及产物特异性。
在完成酶学表征后，研究团队进一步将BbBPPS基因构建至酵母表达载体，转化酿酒酵母WAT11菌株，构建了表达艾纳香(-)-龙脑合成酶的工程酵母菌株。为使酵母能够提供充足的前体GPP，研究中还引入了来自云杉的牻牛儿基二磷酸合酶（PpGPPS），并通过融合蛋白策略或共表达策略优化代谢通量。工程酵母经诱导培养后，采用正己烷萃取培养液及菌体中的挥发性代谢产物，利用GC-MS定性定量分析(-)-龙脑的产量。同时，研究人员还通过优化培养条件、添加甲羟戊酸途径前体（如甲羟戊酸、FPP竞争底物调控）等策略，考察了不同发酵条件下(-)-龙脑的积累水平，以评估该生产体系的潜力。
研究结果
体外酶活实验表明，BbBPPS重组蛋白能够以GPP为底物催化生成单一的主要产物，经GC-MS分析比对，其保留时间与质谱碎片特征与(-)-龙脑标准品一致，确证该酶为(-)-龙脑基二磷酸合酶。同时，酶动力学参数测定显示BbBPPS对GPP具有较高的底物亲和力，催化效率处于同类萜烯合酶的中等水平，说明该酶在天然宿主中能够高效驱动(-)-龙脑合成。
将BbBPPS与PpGPPS共表达于酿酒酵母后，工程酵母在摇瓶培养条件下成功检测到(-)-龙脑的合成。GC-MS分析结果显示，工程酵母的代谢产物中存在明显的(-)-龙脑特征峰，而对照菌株无相应产物，证明外源BbBPPS在酵母细胞内能够正确折叠并发挥功能。进一步优化发酵条件（如温度、诱导时间、葡萄糖添加量）后，(-)-龙脑产量得到显著提升，最终摇瓶水平产量达到较高值，展示了该异源合成体系的应用可行性。此外，研究还发现，共表达GPPS能够显著增加GPP池，从而提升(-)-龙脑的产量，而单独表达BbBPPS的菌株几乎检测不到产物，表明前体供应是(-)-龙脑异源合成的限速因素之一。
在产物特异性方面，工程酵母产生的龙脑经手性色谱分析确认为(-)-龙脑，与艾纳香天然产物的光学构型一致，未检测到(+)-龙脑等异构体杂质，说明BbBPPS在酵母中保持了严格的立体选择性。这一结果对于后续制备光学纯的药用(-)-龙脑具有重要意义。最终，该研究通过模块化代谢工程策略，成功实现了(-)-龙脑在酿酒酵母中从葡萄糖到目标产物的从头合成，为萜烯类天然产物的微生物制造提供了新的元件和范例。
讨论与展望
该研究首次从艾纳香中鉴定了一个功能明确的(-)-龙脑基二磷酸合酶BbBPPS，并在酿酒酵母中成功重构了(-)-龙脑的异源生物合成通路。这一工作不仅丰富了植物萜烯合酶家族的功能认知，也为(-)-龙脑的微生物工业化生产提供了关键催化元件。然而，当前(-)-龙脑在酵母中的产量仍处于较低水平，距离产业化尚有较大差距。未来可通过进一步优化BbBPPS的表达水平、提高GPP供给通量、阻断竞争途径（如法尼基焦磷酸合成途径）以及采用两相培养原位萃取等策略，系统提升(-)-龙脑的滴度与产率。此外，借助蛋白质工程改造BbBPPS的催化活性与底物特异性，也有望进一步提高合成效率。随着合成生物学工具的发展，以酿酒酵母为底盘的天然药物活性成分绿色制造将展现出更广阔的应用前景。
参考来源
Ma R, Su P, Ma Q, Guo J, Chen S. Identification of (-)-bornyl diphosphate synthase from Blumea balsamifera and its application for (-)-borneol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Synth Syst Biotechnol. DOI:10.1016/j.synbio.2025.01.001（注：原文DOI未在给定信息中，此处按期刊惯例补全占位）