来源：Front Genome Ed | 编译：DNA Lab Space
甜菜是全球重要的糖料作物，但传统育种周期长、效率低，严重制约了品种改良进程。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术为作物精准育种提供了革命性工具，然而甜菜中高效、稳定的基因编辑平台一直缺乏。本研究以甜菜内源镁螯合酶基因（BvCHLI）和八氢番茄红素脱氢酶基因（BvPDS）为靶点，系统建立了基于CRISPR/Cas9的甜菜基因编辑技术体系，通过构建双靶点编辑载体、优化农杆菌介导的遗传转化与再生流程，成功获得了白化表型的编辑植株，并验证了靶向位点的编辑效率与遗传稳定性。该平台的建立为甜菜功能基因组学研究及农艺性状定向改良奠定了重要技术基础。
甜菜（Beta vulgaris L.）作为世界上仅次于甘蔗的第二大糖料作物，贡献了全球约20%的食糖产量。此外，甜菜在生物燃料、饲料及功能性食品开发等领域也具有重要价值。然而，甜菜属于二年生作物，世代周期长，且高度自交不亲和，传统杂交育种通常需要8-10年才能育成新品种，难以应对气候变化和病虫害频发带来的挑战。基因编辑技术能够在单个世代内实现目标基因的精准敲除或修饰，为甜菜育种开辟了全新路径。其中，CRISPR/Cas9系统因其操作简便、靶向精准、效率高等优势，已在水稻、小麦、玉米等多种作物中成功应用，但在甜菜中的报道相对有限。甜菜遗传转化效率低、再生体系不完善，加之基因组复杂性较高，均制约了基因编辑技术在甜菜中的推广。因此，建立一套高效、可重复的甜菜CRISPR/Cas9编辑平台，对于推动甜菜分子育种和基因功能研究具有重要意义。镁螯合酶（Magnesium chelatase）是叶绿素生物合成途径中的关键酶，其I亚基由CHLI基因编码；该基因突变可导致叶绿素合成受阻，植株呈现白化或黄化表型，因而是基因编辑效率可视化筛选的理想报告基因。八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase, PDS）参与类胡萝卜素生物合成，其功能缺失同样会引发白化表型。本研究选择这两个基因作为靶点，既可通过肉眼观察白化表型快速判断编辑事件是否发生，又为后续编辑其他功能基因提供了方法学参考。
本研究首先从甜菜品种‘C869’基因组中克隆了BvCHLI和BvPDS基因片段，通过测序确认外显子序列后，利用在线工具设计了分别靶向BvCHLI第一外显子和BvPDS第一外显子的单链向导RNA（sgRNA）。为避免脱靶效应，所有候选sgRNA均经BLAST比对，选取与甜菜基因组其他区域同源性最低的序列。随后，研究者构建了双基因编辑载体——将两个sgRNA表达盒（各自由拟南芥U6启动子驱动）与Cas9蛋白表达框（由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动）共同组装到植物双元载体中，并引入卡那霉素抗性基因作为筛选标记。载体经测序验证后，转化至农杆菌GV3101菌株中备用。遗传转化采用甜菜子叶节作为外植体，系统优化了预培养时间、农杆菌侵染浓度、共培养天数及筛选剂浓度等关键参数。转化后的外植体在含卡那霉素的培养基上诱导不定芽，待抗性芽生长至约3厘米时切下，转移至生根培养基中培养。再生植株移栽后，提取叶片基因组DNA，使用跨越靶位点的特异性引物进行PCR扩增，并通过Sanger测序鉴定突变类型与突变频率。同时，研究还对T0代编辑植株进行了表型观察，包括叶片颜色、株高及叶绿素含量测定，以评估基因编辑对植株生理特性的影响。
实验结果显示，在遗传转化过程中，外植体经农杆菌感染和卡那霉素筛选后，约有60%的外植体能够诱导出抗性愈伤组织，其中约35%进一步分化出不定芽，最终成功获得54株独立再生的T0代甜菜植株。对这些植株进行基因分型检测后发现，BvCHLI靶位点的编辑效率为38.9%（21/54），BvPDS靶位点的编辑效率为29.6%（16/54），而两个基因同时发生编辑的双突变体比例为13.0%（7/54）。Sanger测序峰图分析表明，编辑类型以1-3个碱基的插入或缺失（InDel）为主，也检测到少量碱基替换事件，符合CRISPR/Cas9诱导DNA双链断裂后经非同源末端连接（NHEJ）修复的典型特征。在突变序列中，移码突变占比较高，约65%的编辑等位基因导致翻译提前终止，从而造成基因功能完全丧失。表型观察方面，BvCHLI纯合突变的植株叶片呈现出明显的黄绿色表型，叶绿素a和叶绿素b含量分别较野生型下降了约72%和68%；而BvPDS纯合突变植株则表现为白化苗，在含蔗糖的培养基上虽能存活但无法进行有效光合作用，移栽土壤后逐渐死亡，这与PDS功能缺失导致光漂白现象的预期一致。值得注意的是，在双突变体植株中，白化程度更加严重，且部分植株出现叶片畸形和生长停滞，表明两个基因的突变存在协同效应。此外，研究还随机选取了3个编辑事件进行脱靶预测分析，在预测位点中未发现非目标区域的突变，初步证明该编辑系统具有良好的靶向特异性。
本研究成功构建了适用于甜菜的CRISPR/Cas9双基因编辑技术体系，证明了通过农杆菌介导转化甜菜子叶节可以实现高效的靶向基因敲除。研究采用的“白化标记”策略具有直观、快速的优势，无需依赖分子检测即可初步判断编辑是否成功，显著降低了筛选工作量。镁螯合酶和八氢番茄红素脱氢酶作为植物体内高度保守的功能基因，其编辑表型清晰，为优化甜菜编辑条件提供了可靠的视觉报告系统。然而，当前平台仍存在一定局限性：整体转化效率仍然偏低，基因型依赖性较强，所测试的品种‘C869’可能无法代表所有甜菜种质；同时，T0代中嵌合体比例较高，需要通过自交或组织培养获得纯合稳定后代。未来研究可在以下方向深入拓展：一是采用形态发生基因（如Bbm、Wus2）共表达策略，提高甜菜遗传转化效率和再生能力；二是开发组织特异性启动子驱动Cas9表达，以降低嵌合体产生频率；三是将该平台拓展至甜菜其他重要农艺性状相关基因（如抗病基因、耐盐碱基因）的功能解析与精准编辑。此外，随着碱基编辑和引导编辑技术的发展，未来有望在甜菜中实现单碱基替换和精确片段插入，从而加速甜菜设计育种进程。本研究所建立的基因编辑平台，不仅为甜菜功能基因组研究提供了高效工具，也为其他转化困难的二年生作物开展基因编辑提供了可借鉴的技术路径。
参考来源
Khan ZA, Hathaway T, Chu C, Gupta R, Bolton M. CRISPR/Cas9-based gene-editing platform development by targeting genes encoding magnesium chelatase and phytoene desaturase in sugarbeet (Beta vulgaris L.). Front Genome Ed. DOI: 未标注.