来源：AMB Express | 编译：DNA Lab Space
右旋糖酐酶是糖加工和医药领域的重要工业酶制剂，然而天然黑曲霉菌株的产酶水平往往难以满足生产需求。中国科学院天津工业生物技术研究所黄欣等研究人员采用常压室温等离子体（ARTP）诱变与异源表达相结合的策略，显著提升了右旋糖酐酶在黑曲霉中的分泌表达水平。该研究展示了“物理诱变创制优良底盘”与“基因工程强化合成能力”协同作用的可行性，为工业微生物酶制剂的开发提供了高效、实用的研究范式。
研究背景
右旋糖酐酶（dextranase，EC 3.2.1.11）能够特异性地水解右旋糖酐分子中的α-1,6糖苷键，在制糖工业中用于降低蔗汁和糖浆的黏度、防止管道堵塞，同时在口腔护理领域可分解牙菌斑中的葡聚糖，是防龋齿牙膏和漱口水的重要活性成分。工业上，右旋糖酐酶主要由曲霉属和毛壳霉属等丝状真菌发酵生产，其中黑曲霉（Aspergillus niger）因具有强大的蛋白分泌系统且被公认安全，是最具潜力的生产宿主之一。但野生型黑曲霉的右旋糖酐酶表达量较低，且发酵周期长、成本高，限制了其大规模应用。
传统的紫外诱变、化学诱变等方法虽然能够在一定程度上提高产量，但存在操作安全性差、突变效率低、诱变损伤难以控制等缺点。常压室温等离子体（ARTP）作为一种新型物理诱变技术，能够在常压、室温条件下产生高密度等离子体射流，对微生物细胞造成多种类型的DNA损伤，进而诱发高频、随机突变，具有操作简便、参数可控、突变谱广等优势，近年来已在工业微生物菌种改良中得到广泛应用。另一方面，异源表达技术可将目标基因置于强启动子和优化信号肽的控制下，借助黑曲霉独有的蛋白质折叠和分泌机制实现高水平的胞外分泌。然而，单纯依赖异源表达往往受限于宿主本身的遗传背景和生产适应性，而单纯诱变筛选则难以突破内源调控网络的限制。因此，将ARTP诱变与异源表达有机结合，有望在优化宿主底盘的同时强化目标酶的合成能力，实现“菌株性能”与“表达系统”的双重提升。
研究方法
该研究的技术路线围绕“诱变—筛选—克隆—表达—表征”五个环节展开。研究人员首先对野生型黑曲霉的新鲜孢子悬液进行ARTP诱变处理，通过设定不同的处理功率和照射时间（如60秒、90秒、120秒等）构建突变体文库。通过统计致死率与正突变率，确定最佳诱变剂量，确保在获得足够突变多样性的同时保留较高的菌株存活率。随后，利用以蓝色葡聚糖为底物的选择平板进行高通量初筛，依据透明圈直径与菌落直径的比值初步判断突变株的产酶水平，再经摇瓶复筛确认优良突变株。经连续传代培养验证遗传稳定性后，获得一株产酶能力显著提升的ARTP突变菌株。
在异源表达环节，研究人员从突变株基因组中克隆了右旋糖酐酶编码基因（dex），经测序比对确认其完整开放阅读框。以黑曲霉表达载体为基础，构建了由强启动子（如糖化酶启动子 glaA）驱动、携带分泌信号肽的重组表达质粒，并通过原生质体转化法导入黑曲霉感受态细胞。使用含有潮霉素或博来霉素等选择标记的培养基筛选阳性转化子，结合PCR和Southern blot验证外源基因的插入及拷贝数。随后对重组菌株进行摇瓶发酵，通过SDS-PAGE电泳和右旋糖酐酶活性染色确认目标蛋白的分泌表达，并利用DNS比色法测定酶活力。最后，对重组右旋糖酐酶的酶学性质进行系统表征，包括最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性以及金属离子和化学试剂的影响，以评估该酶的工业应用潜力。同时，比较了原始菌株、ARTP突变菌株和重组表达菌株在相同条件下的产酶水平，以定量评价不同策略的增效贡献。
研究结果
通过ARTP诱变处理，研究人员在合适的致死率条件下获得了一系列遗传稳定的突变株。摇瓶复筛结果显示，最优突变株的右旋糖酐酶产量较出发菌株提高了约2.3倍，且经过5次以上连续传代后酶活水平无明显回落，表明该突变性状具有良好的遗传稳定性。酶谱分析显示，突变株胞外蛋白条带中对应于右旋糖酐酶的蛋白丰度明显增强，说明其分泌能力或基因表达水平发生了有利改变。
在异源表达方面，成功构建的dex基因重组表达载体经由原生质体转化整合至黑曲霉基因组中，阳性转化子经PCR验证均含有完整的表达盒。摇瓶发酵结果表明，重组菌株的胞外右