来源：Plant Biotechnol J | 编译：DNA Lab Space
导语
合成生物学致力于将工程学原理应用于生物系统改造，而蛋白质支架作为空间组织功能模块的关键工具，在微生物体系中已取得显著进展，但在植物中的开发相对滞后。本研究首次系统评估了源自沙门氏菌噬菌体P22的病毒样颗粒（VLP）作为蛋白质纳米支架在植物细胞内组装与靶向递送的可行性，证实了P22 VLP可作为模块化蛋白质支架在植物合成生物学中发挥重要作用，为植物细胞中的多酶共定位和代谢通路重构提供了全新工具。
研究背景
在合成生物学研究中，通过人工设计的蛋白质支架将酶促反应通路中的多种酶进行空间组织，可有效提高代谢通量并减少中间代谢物的扩散损失。目前在微生物体系中已发展出多种支架策略，包括使用夹钳蛋白（clips）、DNA折纸以及病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs）等纳米结构。其中，噬菌体来源的VLP因其自组装特性、遗传可操作性以及空腔结构的封装能力而备受关注。
P22噬菌体VLP来自沙门氏菌噬菌体P22，其外壳蛋白能自组装形成直径为58纳米的二十面体颗粒，可通过衣壳组装（assembly）结构域（也称为支架蛋白结构域）将外源蛋白展示在颗粒内部或外部。在细菌和哺乳动物细胞中，P22 VLP已被证明能够通过基因融合表达的方式实现外源蛋白的包装和表面展示。然而，在植物细胞中，这种基于VLP的蛋白质支架策略尚未得到充分验证。考虑到植物作为生物制造平台的独特优势——低成本、可扩展性以及真核翻译后修饰能力——开发适用于植物细胞的VLP支架系统具有重要价值。本研究旨在探索P22 VLP在植物细胞内是否能够正确组装，以及能否作为一种通用的纳米级蛋白质支架实现功能蛋白的靶向递送和空间组织。
研究方法
研究团队采用农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中系统评估了P22 VLP作为蛋白质纳米支架的性能。首先，研究人员构建了表达P22外壳蛋白（CP）的植物表达载体，通过共表达策略在植物细胞内诱导VLP自组装。为验证VLP的组装能力，研究人员采用蔗糖密度梯度离心从植物叶片总蛋白提取物中纯化VLP，并通过透射电子显微镜观察颗粒形态。
在此基础上，研究进一步设计了融合蛋白策略。通过将P22衣壳组装结构域（也称为支架蛋白结构域，SP）与荧光蛋白或功能酶融合，研究人员构建了能够被包装进VLP内部的“货物蛋白”。利用共聚焦显微镜观察荧光信号的亚细胞定位，验证货物蛋白是否被成功封装入VLP空腔内。
为了拓展该支架系统的应用范围，研究还探索了VLP表面的功能性修饰。他们将P22外壳蛋白的C端与荧光蛋白进行基因融合，使得荧光蛋白展示在VLP颗粒的外表面。此外，研究还测试了不同受体靶向策略——将VLP表面展示的蛋白与细胞核定位信号或细胞质定位信号融合，以验证VLP能够引导货物蛋白在细胞内的定向递送。所有构建体均通过农杆菌浸润（agroinfiltration）方式导入植物叶片，浸润后数天收取叶片组织进行蛋白提取和分析。通过Western blot验证融合蛋白的表达，并通过荧光成像和免疫金标记等手段对VLP进行亚细胞定位和形态学表征。
研究结果
研究结果表明，P22 VLP能够在本氏烟草叶片中高效自组装形成正确的二十面体结构。通过蔗糖密度梯度离心和透射电子显微镜分析，研究人员在植物叶片提取物中观察到了典型P22 VLP颗粒，颗粒大小均一，形态与在大肠杆菌中组装的VLP一致。这一发现证实P22外壳蛋白在植物细胞环境中能够正确折叠并完成自组装过程。
进一步的荧光定位实验揭示了VLP作为货物蛋白载体的功能。当研究人员将荧光蛋白（如mNeonGreen）与支架蛋白结构域融合并在植物叶片中与CP共表达时，荧光信号呈现为离散的点状结构，且在细胞核周围区域形成聚集。这种点状分布模式与游离表达的荧光蛋白（均匀分布在细胞质中）明显不同，表明货物蛋白被成功包装进VLP内部。免疫金标记实验进一步确认了VLP颗粒在细胞内的分布。
在外表面展示方面，研究人员成功实现了荧光蛋白在P22颗粒表面的展示。融合了CP与荧光蛋白外壳蛋白在植物细胞中组装形成了荧光标记的VLP，这些颗粒不仅能够正确组装，还能被靶向到特定的亚细胞位置。值得注意的是，当研究人员将细胞核定位信号融合到表面展示的货物蛋白上时，VLP能够将货物蛋白有效递送至细胞核区域，在细胞核内观察到明显的荧光信号。相比之下，没有VLP外壳的对照（单独表达融合蛋白）虽然也能进入细胞核，但在VLP介导递送的情况下信号在靶区域的富集和稳定性均有所提高。
关于VLP支架的代谢工程应用初探同样取得了令人鼓舞的结果。研究人员以参与植物萜类生物合成的关键酶——牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS）为模型货物蛋白，将其通过SP融合包装进P22 VLP中。结果显示，被封装进VLP的GGPPS在植物叶片中保持了酶活性，且VLP包装并未显著影响其催化功能。更有意思的是，当研究人员通过共表达策略在一个VLP颗粒中同时包装了GGPPS和一个与其偶联的荧光标记蛋白时，两种蛋白被同时封装进同一颗粒中，表明P22 VLP具有共封装多种蛋白质的能力——这是构建多酶复合体的关键前提。定量分析显示，VLP包装的GGPPS其酶活回收率约为游离酶的68%，差异可能与封装过程中的空间位阻效应有关。
讨论与展望
本研究通过系统实验验证了P22 VLP在植物细胞中作为蛋白质纳米支架的可行性。重要之处在于，P22 VLP不仅能够在植物细胞内正确自组装，还能通过基因融合策略实现外源蛋白的内腔包装和表面展示，并可根据应用需求将货物蛋白靶向递送至特定亚细胞区域。这种灵活性和模块化特性使P22 VLP成为植物合成生物学工具箱中的有力补充。与传统基于蛋白质-蛋白质相互作用的支架策略相比，VLP支架具有明确的几何结构和可调控的装载量，理论上能够实现更精确的代谢通路空间重构。
当然，本研究仍存在一些局限性。目前P22 VLP介导的酶递送虽然保持了酶活性，但酶活回收率有所降低，说明VLP的内部空间微环境可能对某些酶折叠或底物结合产生一定影响。此外，P22 VLP对货物蛋白的装载容量以及多种酶在同一颗粒中的化学计量比调控仍需进一步优化和定量表征。未来的研究可以聚焦于开发可诱导的VLP解组装-再组装系统，以实现更精准的货物释放，并拓展该平台在植物代谢工程、分子农业以及植物生物制药领域的应用。随着更多纳米支架策略在植物中的开发和优化，植物合成生物学将有望实现更复杂、更高效的代谢通路设计与重构。
参考来源
Harding MD, Jackson MA, Gilding EK, Craik DJ, Sainsbury F. Bacteriophage P22 Virus‐Like Particles as Nanoscale Protein Scaffolds for Plant Synthetic Biology. Plant Biotechnology Journal. DOI: 10.1111/pbi.70004