来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导语
非天然氨基酸的位点特异性掺入是蛋白质工程与化学生物学研究的重要手段，但传统方法依赖于外源添加化学合成的非天然氨基酸，步骤繁琐且成本高昂。本研究报道了一种将非天然氨基酸的体内生物合成与遗传密码子扩展技术相偶联的策略，直接从芳基醛或羧酸底物出发，在大肠杆菌中合成多种苯丙氨酸衍生物，并将其位点特异性地整合到目标蛋白中。这一“边合成、边掺入”的联合平台显著简化了非天然氨基酸的获取与应用流程，为蛋白质精准修饰和功能探针开发提供了更简洁、通用的方案。
研究背景
遗传密码子扩展技术利用正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，在无义密码子（如UAG）处将非天然氨基酸（ncAAs）位点特异性地掺入蛋白质。近二十年来，该技术已成功实现上百种非天然氨基酸在活细胞内的翻译整合，被广泛应用于荧光标记、光交联、蛋白质递送及新功能创制等研究。然而，绝大多数非天然氨基酸必须通过繁琐的多步化学合成获得，且许多疏水性氨基酸难以穿透细胞膜，需要通过酯化等策略提高透膜能力，极大地限制了该技术的通量和实用性。一些替代方案，如使用营养缺陷型菌株结合前体喂养，只能用于天然氨基酸类似物，而缺乏通用性。因此，如何在细胞内直接从经济、可溶的小分子前体合成目标非天然氨基酸，并使之进入正交翻译系统，成为合成生物学领域一项有价值但充满挑战的目标。本研究正是针对这一瓶颈，提出将酶促生物合成与遗传密码子扩展结合起来的一体化策略，从来源广泛、价格低廉的芳基醛或芳香羧酸出发，在大肠杆菌内就地合成多种苯丙氨酸衍生物，并依靠正交翻译系统实现蛋白质的定点掺入，展示了从简单前体到功能化蛋白的完整闭环。
研究方法
研究者设计并构建了一套“双模块”大肠杆菌表达系统，将非天然氨基酸的体内生物合成与位点特异性翻译整合在同一细胞中。该系统的第一个模块为生物合成模块，负责将外源添加的芳基醛或芳香羧酸转化为相应的苯丙氨酸衍生物。其核心策略是首先通过羧酸还原酶或醛脱氢酶等酶将羧酸与醛互为转化，再经碳碳键形成及转氨作用生成α-氨基酸骨架。更具体而言，研究者在大肠杆菌中共表达了多个酶：一是芳香醛裂解酶或醛缩酶，使芳基醛与丙酮酸缩合形成对应的2-氧代-3-芳基丙酸；二是支链氨基转移酶，以谷氨酸或天冬氨酸为氨基供体，将2-氧代酸转化为最终的L-苯丙氨酸衍生物。这样的两步酶级联能够兼容对位、间位带有氟、氯、甲氧基、硝基、叠氮基、乙酰基等不同取代基的苯甲醛类底物，从而生成一系列侧链多样的非天然苯丙氨酸。
第二个模块为正交翻译模块，使用来自詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）的酪氨酰-tRNA合成酶（MjTyrRS）/tRNA对作为脚手架，通过活性位点定向突变改造合成酶，使其能特异识别上述生物合成的非天然氨基酸，而不识别内源氨基酸。研究者将突变合成酶及其同源tRNA（tRNA^Tyr_CUA）置于一个阿拉伯糖诱导型质粒上，同时将含有一个或多个TAG琥珀密码子的荧光报告基因（如sfGFP）置于另一个组成型或诱导型质粒上。在培养体系中加入不同芳基醛或芳香羧酸底物后，生物合成模块在胞内生成目标非天然氨基酸，正交翻译模块随即将其“捕获”并转运至核糖体，在琥珀密码子处掺入蛋白质。
为了验证该系统的通用性，研究者测试了多种芳基醛和芳香羧酸底物，并对底物浓度、诱导时间、酶表达量等参数进行了优化。通过观察报告蛋白的荧光恢复来快速判断掺入是否成功；对纯化后的目标蛋白进一步采用LC-ESI-MS/MS进行分析，以确认非天然氨基酸所在肽段的质量变化，从而严格验证掺入的精确位点和完整性。同时，研究人员还利用叠氮基类似物的炔基环加成反应（点击化学）进行荧光标记，考察了所得蛋白的后续生物正交反应活性。
研究结果
本研究成功证明了“联合生物合成+位点