来源：Sustainable and intensified nicotinamide biomanufacturing by a robust Rhodococcus sp. SCUT10 chassis leveraging waste-derived nutrient reinforcement（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
烟酰胺（维生素B3）是全球需求激增的重要辅酶前体，但传统化学合成路线存在高能耗与重金属污染问题。本研究从丙烯腈污染场地分离获得一株兼具高热稳定性与高效腈水合酶活性的Rhodococcus sp. SCUT10菌株，并创新性地将废弃鸡毛水解物（CFH）作为功能性营养强化剂。通过响应面优化与7-L生物反应器补料策略，实现2760 U/mL的体积酶活与886 g/L烟酰胺产量，产率达1181 g L⁻¹ h⁻¹，为维生素级酰胺的绿色生物制造提供了可扩展的废弃物增值方案。
研究背景
烟酰胺是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化衍生物（NADP⁺）生物合成的关键前体，参与超过400种生化氧化还原反应。随着皮肤病学、临床营养学及动物饲料补充剂等领域的应用拓展，其全球需求持续攀升。然而，传统工业生产依赖烟酸或3-氰基吡啶的多步化学合成，需高温高压及重金属催化剂，原子经济性欠佳且产生有害副产物。以腈水合酶（NHase，EC 4.2.1.84）催化3-氰基吡啶水合制备烟酰胺，可在常温常压下实现一步高区域选择性转化，是理想的绿色替代路线。但工业应用长期受制于微生物催化剂对高浓度底物和产物的耐受性不足。本研究旨在从污染环境中筛选耐受性优异的天然NHase产生菌株，并探索废弃物资源化利用与过程强化的协同策略。
研究方法
2.1 耐腈菌株的样品采集、富集与分离
从广东省两家使用丙烯腈的化工厂（广州顺邦高分子材料科技有限公司、珠海平一化工有限公司）采集土壤、污泥和废水样品。微生物富集在30°C条件下进行，使用葡萄糖基础培养基（20 g/L葡萄糖、0.5 g/L酵母提取物、2 g/L K₂HPO₄、10 mg/L CoCl₂·6H₂O和1 g/L NaCl）。为筛选耐腈能力强的菌株，丙烯腈浓度在五次连续传代培养中从0.1%（v/v）逐步提高至0.5%（v/v）。富集后的菌群经梯度稀释后涂布于含0.5%（v/v）丙烯腈的固体矿物质培养基上。挑取单菌落并通过反复划线进一步纯化，最终分离株保存于20%（v/v）甘油中，置于−80°C备用。
【数据】富集温度：30°C；培养基：葡萄糖基础培养基（20 g/L葡萄糖、0.5 g/L酵母提取物、2 g/L K₂HPO₄、10 mg/L CoCl₂·6H₂O、1 g/L NaCl）；丙烯腈浓度梯度：0.1%→0.5%（v/v）；传代次数：5次；保存条件：20%甘油、−80°C
2.2 培养基与摇瓶发酵
细菌分离株在胰酪大豆肉汤（TSB）中活化制备种子培养液。除非另有说明，摇瓶发酵以1%（v/v）接种量将种子培养液接种至生产培养基中，于30°C培养48小时。以专利文献中R. rhodochrous NCIMB 41164的未优化基础培养基（Medium P）为起点，其组分为：10 g/L葡萄糖、3 g/L酵母提取物（YE）、1 g/L蛋白胨、0.7 g/L K₂HPO₄、0.3 g/L KH₂PO₄、5 g/L尿素、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O和10 mg/L CoCl₂·6H₂O。作为对照，采用Liang等报道的文献培养基（Medium L），详细组成见补充材料（Supplementary Methods）。最终优化的发酵培养基用于后续所有实验和生物反应器研究，其组分为：22.5 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母提取物、1.04 g/L CFH、0.5 g/L蛋白胨、7.5 g/L尿素、0.3 g/L KH₂PO₄、0.7 g/L K₂HPO₄、35 mg/L CoCl₂·6H₂O和0.5 g/L MgSO₄·7H₂O。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养条件：30°C、48h；基础培养基（Medium P）：10 g/L葡萄糖、3 g/L YE、1 g/L蛋白胨、0.7 g/L K₂HPO₄、0.3 g/L KH₂PO₄、5 g/L尿素、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、10 mg/L CoCl₂·6H₂O；优化培养基：22.5 g/L葡萄糖、6.7 g/L YE、1.04 g/L CFH、0.5 g/L蛋白胨、7.5 g/L尿素、0.3 g/L KH₂PO₄、0.7 g/L K₂HPO₄、35 mg/L CoCl₂·6H₂O、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O
2.3 腈降解活性的初筛
采用基于溴百里酚蓝（BTB）的96孔板比色法对分离株进行快速初筛，方法参照文献并作少量修改。每孔含160 μL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）、0.01%（w/v）BTB和20 μL细胞悬液（OD600 ≈ 40）。通过向测试孔中加入4 μL 500 mmol/L 3-氰基吡啶启动酶促反应，对照孔加入等体积蒸馏水。在45°C孵育24小时后，使用酶标仪测定616 nm处吸光度。相对腈降解活性以吸光度变化（ΔA616 = A616,测试 − A616,对照）量化。ΔA616 < 0的分离株被鉴定为阳性候选菌株，进入后续功能验证。
【数据】缓冲液：10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）；BTB浓度：0.01%（w/v）；细胞悬液OD600：≈40；底物：4 μL 500 mmol/L 3-氰基吡啶；反应条件：45°C、24h；检测波长：616 nm；阳性判定：ΔA616 < 0
2.4 菌株鉴定与NHase基因分析
SCUT10在TSA平板上于30°C培养后观察菌落形态。细胞形态和革兰氏染色特性使用商业革兰氏染色试剂盒（环凯微生物，货号029010，广东，中国）按制造商说明确定。分子鉴定方面，使用通用引物（27F/1492R）PCR扩增16S rRNA基因，并通过Sanger测序（生工生物，广州，中国）测定序列。所得序列使用BLASTn与GenBank数据库比对，使用MEGA软件以邻接法构建系统发育树，自举值基于1000次重复计算。为确定NHase亚型，通过PCR检测SCUT10中高分子量（H型）和低分子量（L型）NHase基因的存在。引物组以R. rhodochrous J1的H-NHase和L-NHase基因序列为参考设计。PCR产物通过Sanger测序进行基因表征验证，所得序列汇总于补充材料表S1。详细引物序列和PCR程序见补充材料（Supplementary Methods）。
【数据】培养温度：30°C；16S rRNA引物：27F/1492R；系统发育树方法：邻接法、1000次自举；H-NHase PCR产物大小：约1.4 kb
2.5 HPLC法测定NHase活性
SCUT10对3-氰基吡啶的生物催化活性使用磷酸盐缓冲液中的静息细胞悬液测定。标准反应（0.5 mL）含400 mmol/L 3-氰基吡啶和0.18 mg细胞干重（DCW）的细胞，缓冲液为10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。反应在25°C下进行10分钟，随后加入等体积（500 μL）冰浴预冷的乙腈终止反应。离心（12,000 rpm，5分钟）后，上清液用流动相适当稀释并经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。定量分析使用配备TC-C18(2)反相色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）的Agilent HPLC系统完成。流动相为20%（v/v）乙腈的10 mmol/L KH₂PO₄水溶液（用H₃PO₄调pH至2.8）。分离条件为流速0.8 mL/min、柱温25°C、UV检测波长220 nm、进样量10 μL。1单位（U）NHase活性定义为在指定条件下每分钟产生1 μmol烟酰胺所需的静息细胞量。体积活性以U/mL发酵液表示。
【数据】底物浓度：400 mmol/L 3-氰基吡啶；细胞量：0.18 mg DCW；缓冲液：10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）；反应条件：25°C、10min；终止剂：等体积冰浴乙腈；离心：12,000 rpm、5min；色谱柱：TC-C18(2)（4.6 × 250 mm，5 μm）；流动相：20%乙腈/10 mmol/L KH₂PO₄（pH 2.8）；流速：0.8 mL/min；检测：UV 220 nm；进样量：10 μL
2.6 鸡毛水解物（CFH）的制备
CFH通过使用Streptomyces sp. SCUT-3对家禽废弃物进行微生物水解获得，方法参照Li等的报道。水解后的液体在65°C下干燥并研磨成细粉。以蒸馏水配制10%（w/v）CFH储备液，经高压灭菌（121°C，20分钟）后，离心（10,000 rpm，10分钟）去除不溶性残渣。澄清的储备液于4°C保存备用。澄清CFH储备液中游离氨基酸浓度采用茚三酮比色法测定。可溶性蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒（生工，货号C503021，上海，中国）测定。
【数据】水解菌株：Streptomyces sp. SCUT-3；干燥温度：65°C；储备液浓度：10%（w/v）；灭菌条件：121°C、20min；离心：10,000 rpm、10min；储存温度：4°C；氨基酸测定：茚三酮比色法；蛋白测定：BCA试剂盒
2.7 培养基优化的实验设计
采用序贯统计方法最大化NHase产量。首先进行单因素实验确定各培养基组分的适宜工作范围。随后利用Plackett-Burman（PB）设计（12次试验）筛选影响体积NHase活性的最显著变量。为探究关键因素间的交互作用并确定其最优浓度，应用中心复合设计（CCD）。实验数据使用Design-Expert软件分析生成二阶多项式模型。详细因素水平和设计矩阵见补充材料。
【数据】PB设计：12次试验；优化方法：单因素实验→PB设计→CCD；分析软件：Design-Expert
2.8 7-L生物反应器补料发酵
在7-L搅拌釜生物反应器（工作体积3 L）中使用最终优化培养基进行工艺放大评估。种子培养液通过接种150 mL TSB或优化培养基，于30°C、220 rpm培养24小时制备。反应器以5%（v/v）接种量接种，于30°C运行。初始葡萄糖耗尽后，通过两种不同策略补加浓缩补料（含400 g/L葡萄糖和0.01 g/L CoCl₂·6H₂O）：恒速补料（4 mL/h）或间歇脉冲补料以维持残余葡萄糖浓度约为10 g/L。通过添加氨水（10%，w/v）自动维持pH为7.0，溶解氧（DO）通过通气量和搅拌速度的联动调节控制。根据需泡沬情况手动添加消泡剂。
【数据】反应器：7-L搅拌釜（工作体积3 L）；种子培养：150 mL、30°C、220 rpm、24h；接种量：5%（v/v）；补料组成：400 g/L葡萄糖、0.01 g/L CoCl₂·6H₂O；恒速补料：4 mL/h；脉冲补料维持葡萄糖：约10 g/L；pH：7.0（10%氨水自动维持）
2.9 烟酰胺生产的补料分批反应
补料分批生物转化使用静息细胞进行，具体操作条件在结果部分详细描述。
【数据】原文未详述（后续结果部分详述）
研究结果
3.1 稳健生物催化底盘菌株Rhodococcus sp. SCUT10的发现与筛选
腈水合酶（NHase）的工业应用常受限于腈类底物的高毒性及反应放热特性，因此需要兼具优异化学耐受性和热稳定性的生物催化底盘。为发现稳健的生产菌株，本研究采用丙烯腈——一种高反应活性且有毒的不饱和腈——作为唯一氮源和选择压力，实施了严格的富集策略（图1A）。与3-氰基吡啶不同，丙烯腈通过与细胞亲核物质（如蛋白质硫醇和核酸）发生Michael加成反应，对微生物细胞施加显著更高的生理胁迫。通过五次连续传代并逐步提高丙烯腈浓度（最高至0.5%，v/v），从工业污泥中富集到耐腈微生物菌群，其假设是：在如此严苛条件下存活将筛选出具有卓越代谢稳健性和高效腈解毒途径的菌株。
从17株分离菌株（SCUT1–SCUT17）中，采用溴百里酚蓝（BTB）pH偶联比色法进行快速功能鉴定。虽然NHase介导的水合反应呈pH中性，但天然NHase产生菌株通常共表达酰胺酶，可将生成的酰胺水解为羧酸，导致反应混合物中可观察到的酸化现象。如图1B所示，5株分离菌（SCUT1、SCUT3、SCUT9、SCUT10、SCUT17）表现出明显的产酸活性，其中SCUT10的吸光度变化最为显著（ΔA616 = −0.47）。随后的HPLC-UV验证证实SCUT10具有高效NHase活性，能在短时间内（10分钟）将3-氰基吡啶（保留时间约9.0分钟）快速转化为烟酰胺（保留时间约4.6分钟），初始活性达263 ± 2 U/mL（图1C和D）。值得注意的是，底物峰显著降低，同时形成与烟酰胺标准品色谱行为一致的主要产物峰，凸显了SCUT10全细胞系统的高催化效率。
菌株SCUT10的鉴定和形态学特征得到进一步阐明。在TSA平板上，SCUT10在培养72小时后形成圆形、凸起、具有明显橙红色色素的菌落（图2A和B）。革兰氏染色确认SCUT10为革兰氏阳性菌。值得注意的是，SCUT10表现出显著的形态可塑性，这是红球菌属的典型特征。培养过程中观察到明显的形态转变：36小时时以伸长的分枝丝状体为主（图2C），而72小时时培养物中大部分为碎片化的短杆状或球菌状单元（图2D）。这一观察结果与红球菌的丝状-球菌发育周期一致——红球菌属以环境持久性和强腈生物转化能力著称，支持SCUT10用于高负荷工业生物转化的潜力。基于16S rRNA基因（表S1）的系统发育分析证实SCUT10聚类在红球菌分支内，与Rhodococcus ruber DSM 43338（NR_026185）具有100%序列一致性（99%覆盖率）（图2E）。尽管存在这些分类学相似性，SCUT10源自丙烯腈污染化工场地的独特来源可能反映了其在高负荷腈转化中所需的特化进化适应和耐受机制。
SCUT10作为工业底盘菌株的潜力还体现在其优异的全细胞热稳定性上。鉴于腈水合是放热过程，在升温条件下维持催化活性对于降低冷却能耗至关重要。SCUT10表现出显著的热抗性，在50°C孵育4小时后仍保留超过80%的初始活性（图S2A）。为定量评估失活过程，将动力学拟合至一级失活模型（图S2B）。所得失活速率常数（kd）为0.0452 h⁻¹（R² = 0.9521），计算得到50°C下的半衰期（t₁/₂）约为15.3小时。这一性能显著优于重组系统。作为对比，表达R. rhodochrous J1 H-NHase的大肠杆菌全细胞在低得多的温度（37°C）下t₁/₂仅为4.1小时。SCUT10在更高温度下显著更高的稳定性和更低的kd有力支持了"宿主背景"假说。在红球菌中，富含分枝菌酸的脂质细胞包膜充当抵御热和化学波动的坚固屏障。此外，天然伴侣系统（包括GroEL/ES和热休克蛋白）可能提供保护性"微环境"，使胞内NHase免于变性。这种固有稳健性与其高催化效率相结合，确立了SCUT10作为烟酰胺强化生物生产的高效节能工业底盘菌株的地位。
【数据】分离菌株数：17株（SCUT1–SCUT17）；阳性菌株：SCUT1、SCUT3、SCUT9、SCUT10、SCUT17；SCUT10 ΔA616 = −0.47；初始活性：263 ± 2 U/mL；3-氰基吡啶保留时间：约9.0 min；烟酰胺保留时间：约4.6 min；反应时间：10 min；菌落特征：圆形、凸起、橙红色（72h）；革兰氏染色：阳性；16S rRNA一致性：100%（99%覆盖率，与R. ruber DSM 43338）；热稳定性：50°C、4h保留>80%活性；kd = 0.0452 h⁻¹（R² = 0.9521）；t₁/₂ = 15.3h（50°C）；对比：E. coli重组菌t₁/₂ = 4.1h（37°C）
3.2 SCUT10 H-NHase的遗传与催化特性
为阐明Rhodococcus sp. SCUT10高催化性能的分子基础，首先表征了其NHase基因簇和内在催化选择性。在红球菌中，钴型NHase通常以两种形式存在：低分子量（L-NHase）和高分子量（H-NHase），二者具有不同的底物特异性和工艺耐受性。使用特异性引物对进行PCR分析，确认SCUT10仅含有H-NHase基因簇（约1.4 kb），未获得L-NHase变异体的扩增产物（图3A）。从工业角度看，H-NHase系统的存在是工艺适用性的关键决定因素，因为这类酶与L型对应物相比具有更优的操作稳定性和更高的抗产物抑制能力。序列分析进一步揭示，SCUT10 NHase的α和β亚基与代表性工业菌株R. rhodochrous J1的H-NHase分别具有极高的一致性（99.0%和96.9%）（图3B和C）。
这种高序列一致性表明，仅凭序列比较可能无法完全解释SCUT10的卓越催化性能，凸显了确定其H-NHase与工业菌株R. rhodochrous J1酶之间是否存在细微结构或机制差异的必要性。至关重要的是，尽管两种NHase序列高度相似，SCUT10分离自丙烯腈重度污染场地，长期暴露于该化合物可能施加了强烈的化学选择压力。这种对高毒性亲电性腈的暴露可能选择出细微的进化适应，可能导致NHase催化腔内有利的空间构象或更刚性的NHase亚基界面，从而增强对高产物浓度和渗透压胁迫的耐受性。这些潜在的结构适应可能反映了在化学严苛条件下的适应性进化，与H-NHase系统的独占性一起，共同促成了SCUT10在与烟酰胺生产相关的高负荷腈转化条件下的稳健催化效率。除遗传结构外，还评估了SCUT10胞内NHase-酰胺酶级联的功能协调性，以确保严格的产品纯度。全细胞生物催化中一个普遍存在的挑战是目标酰胺产物被进一步水解为相应的羧酸副产物。
【数据】基因型：仅含H-NHase（约1.4 kb），无L-NHase；α亚基一致性：99.0%（与R. rhodochrous J1）；β亚基一致性：96.9%（与R. rhodochrous J1）
3.3 CFH浓度与氮源供给策略对NHase生产的影响
以CFH为唯一氮源时，考察了不同浓度（1.0–5.0 g/L）对体积NHase活性和细胞生长（OD600）的影响（图4A）。CFH浓度与NHase产量呈显著正相关，但过高的CFH浓度可能导致氮源过量而抑制细胞生长。进一步研究了CFH与尿素等传统氮源的协同效应（图4B），结果表明适量的CFH与尿素组合能够同时促进生物量积累和体积NHase活性，这归因于CFH中丰富的游离氨基酸和小肽提供了额外的碳氮源及可能的生理调节因子。
【数据】CFH浓度范围：1.0–5.0 g/L；协同效应：CFH与尿素组合促进生物量和酶活
3.4 7-L生物反应器放大：两种葡萄糖补料策略的比较
在7-L搅拌釜生物反应器中评估了两种葡萄糖补料策略对SCUT10发酵的影响（图5）。恒速补料（4 mL/h）条件下，细胞生长和NHase活性呈现稳定上升趋势；而间歇脉冲补料维持残余葡萄糖约10 g/L时，细胞密度和体积NHase活性均获得显著提升。通过脉冲补料策略，最终实现高细胞密度（52.3 g DCW/L）和创纪录的体积NHase活性2760 U/mL。这一结果验证了脉冲补料在维持适宜碳源供给、避免葡萄糖过度累积导致的代谢抑制方面的优势。
【数据】恒速补料：4 mL/h；脉冲补料维持葡萄糖：约10 g/L；最大细胞密度：52.3 g DCW/L；最大体积酶活：2760 U/mL
3.5 强化补料分批生物催化生产超高滴度烟酰胺
使用强化后的SCUT10静息细胞进行高强度的补料分批生物转化，在100 mL摇瓶（20 mL工作体积）中、26 ± 2°C条件下，通过间歇补加3-氰基吡啶（每脉冲1.2 mol/L或126 g/L）进行反应（图6A）。通过优化底物补加策略，实现了886 g/L的烟酰胺产量，反应时间仅0.75小时，总产率达1181 g L⁻¹ h⁻¹。摩尔平衡分析证实了接近理论值的转化率，并解释了超高滴度体系中的体积膨胀动力学。该产率创造了烟酰胺生物制造的新纪录。
【数据】反应容器：100 mL摇瓶（20 mL工作体积）；温度：26 ± 2°C；底物补加：3-氰基吡啶，每脉冲1.2 mol/L（126 g/L）；烟酰胺产量：886 g/L；反应时间：0.75h；产率：1181 g L⁻¹ h⁻¹
讨论与解读
本研究构建了基于天然Rhodococcus sp. SCUT10底盘菌株的强化烟酰胺生物催化平台。通过将废弃鸡毛水解物（CFH）作为功能性营养强化剂，并在7-L生物反应器中实施脉冲补料策略，实现了高细胞密度（52.3 g DCW/L）和显著的体积NHase活性（2760 U/mL）。所得全细胞催化剂使生物转化达到886 g/L的滴度和1181 g L⁻¹ h⁻¹的创纪录产率，两者均通过严格的摩尔质量平衡和多尺度表征验证，确保维生素级纯度。未来方向应聚焦于SCUT10底盘菌株的基因工程改造，完全敲除潜在的酰胺酶基因，防止任何潜在胁迫条件下烟酸的形成，以及设计针对高粘度浆料处理优化的专用反应器。此外，还需要进行全面的生命周期评估和技术经济分析，以分别量化使用废弃CFH在工业规模上减少对商业氮源依赖的环境和经济效益。
编译者解读：本研究最大的亮点在于将"菌株筛选—废弃物资源化—过程强化"三个维度有机整合。从污染场地筛选天然高耐受性底盘菌株，避免了重组菌株在工业应用中的稳定性短板；将鸡毛水解物从简单的廉价氮源升级为"生理强化剂"，为废弃物高值化利用提供了新视角；脉冲补料策略在7-L规模上实现2760 U/mL的酶活，展示了良好的放大潜力。886 g/L的产物滴度与1181 g L⁻¹ h⁻¹的产率数据极具说服力，但后续仍需关注酰胺酶副反应的本底控制及超高黏度体系的工业反应器设计问题。
参考来源
Wu, T. Sustainable and intensified nicotinamide biomanufacturing by a robust Rhodococcus sp. SCUT10 chassis leveraging waste-derived nutrient reinforcement. Biomass and Bioenergy, 2027. DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109865
DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109865